用于控制植物有害生物的组合物和方法技术

本文披露了对鳞翅目有害生物有毒的新颖杀昆虫蛋白。编码所述杀昆虫蛋白的DNA可以用于转化原核和真核生物以表达所述杀昆虫蛋白。所述重组生物或含有所述重组生物或所述杀昆虫蛋白的组合物单独或与适当的农用载体组合可以用于控制不同环境中的鳞翅目有害生物。

Compositions and methods for controlling plant pests

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于控制植物有害生物的组合物和方法对电子提交的序列表的引用该序列表的官方副本是以ASCII格式的序列表以2018年8月27日生成的名为“81292-CN-REG-ORG-P_SeqList_ST25.txt”的文件进行电子提交的，并且该序列表的大小为247千字节并且与本说明书同时提交。包含在该ASCII格式文件中的序列表是本说明书的一部分，并且通过引用以其全文结合在此。
本专利技术涉及杀有害生物蛋白和编码它们的核酸分子，连同用于控制植物有害生物的组合物和方法。
技术介绍
苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)是一种革兰氏阳性的孢子形成的土壤细菌，其特征在于它产生晶体包含体的能力，这些晶体包含体对于某些目以及种的植物有害生物(包括昆虫)是特异地有毒的，但是对于植物和其他非靶标生物是无害的。出于这个原因，包含苏云金芽孢杆菌菌株或它们的杀昆虫蛋白的组合物可以用作环境上可接受的杀昆虫剂以控制农业昆虫有害生物或多种人或动物疾病的昆虫载体。来自苏云金芽孢杆菌的晶体(Cry)蛋白主要针对鳞翅目的、双翅目的、以及鞘翅目的有害生物昆虫具有有力的杀昆虫活性。这些蛋白质还已经显示针对以下目的有害生物的活性：膜翅目、同翅目、毛虱目、食毛目、以及壁虱目，连同其他的无脊椎动物目，如线虫动物门、扁形动物门、以及肉足鞭毛亚门(Feitelson,J.,1993,TheBacillusThuringiensisfamilytree[苏云金芽孢杆菌家族树],在：AdvancedEngineeredPesticides[前沿的工程化的杀有害生物剂],马塞尔德克尔公司(MarcelDekker,Inc.),纽约,纽约州)。这些蛋白质最初主要基于它们的杀昆虫活性而被分类为CryI至CryVI。主要的类别是鳞翅目特异性(I)、鳞翅目和双翅目特异性(II)、鞘翅目特异性(III)、双翅目特异性(IV)、以及线虫特异性(V)和(VI)。这些蛋白质进一步被分类为子族；在各个家族内的更高相关的蛋白质指定了区分的字母，如CryIA、CryIB、CryIC等。在各个区分内的甚至更紧密相关的蛋白质被给定名称，例如CryIC(a)、CryIC(b)等。术语“Cry毒素”以及“δ-内毒素”与术语“Cry蛋白”已可互换地使用。对于Cry蛋白和基因的当前命名法基于氨基酸序列同源性而不是昆虫靶标特异性(Crickmore等人,(1998),Microbiol.Mol.Biol.Rev.[微生物分子生物学评论],62:807-813)。在这个更可接受的分类中，每种毒素被指定唯一的名称，所述名称合并了初级等级(阿拉伯数字)、二级等级(大写字母)、三级等级(小写字母)、以及四级等级(另一个阿拉伯数字)。在当前分类中，在初级等级中罗马数字已经换为阿拉伯数字。例如，在旧命名法下的“CryIA(a)”现在在当前命名法下是“Cry1Aa”。根据Ibrahim等人(2010,Bioeng.Bugs[生物工程学蝽象],1:31-50)，Cry毒素仍然可以根据其昆虫宿主特异性被分为六个主要类别并且包括：组1—鳞翅目(例如Cry1、Cry9和Cry15)；组2—鳞翅目和双翅目(例如Cry2)；组3—鞘翅目(Cry3、Cry7和Cry8)；组4—双翅目(Cry4、Cry10、Cry11、Cry16、Cry17、Cry19和Cry20)；组5—鳞翅目和鞘翅目(Cry1I)；以及组6—线虫(Cry6)。Cry1I、Cry2、Cry3、Cry10和Cry11毒素(73–82kDa)是独特的，因为它们似乎是更大Cry1和Cry4蛋白(130–140kDa)的天然截短。Cry蛋白是在Bt的孢子形成阶段期间以结晶形式积聚为原毒素的球状蛋白质分子。在由有害生物摄取后，这些晶体典型地被溶解以释放原毒素，原毒素大小的范围可以为，例如，对于许多鳞翅目有活性的Cry蛋白如Cry1和Cry9为从130-140kDa，并且对于鞘翅目有活性的Cry3蛋白及鳞翅目/双翅目有活性的Cry2蛋白为60-80kDa。在这些晶体被易感昆虫溶解后，这些释放的原毒素被昆虫肠道中的蛋白酶例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶加工，以产生抗蛋白酶的核心Cry蛋白毒素。这种蛋白水解加工涉及从各种Cry原毒素的不同区域去除氨基酸。例如，为130-140kDa的Cry原毒素典型地通过蛋白水解去除25-30个氨基酸的N-末端肽以及C-末端的大约一半的剩余蛋白来激活，产生大约60-70kDa成熟Cry毒素。为60-80kDa的原毒素(例如Cry2和Cry3)也被加工但是其程度不与更大的原毒素相同。与更大的原毒素相比，较小的原毒素典型地从N-末端去除相等或更多个氨基酸，但较少氨基酸被从C-末端去除。例如，Cry2家族成员的蛋白水解激活典型地涉及去除大约40-50个N-末端氨基酸。许多Cry蛋白对特定的靶标昆虫是相当有毒的，但许多具有窄的活性谱。Cry蛋白通常具有五个保守序列结构域、以及三个保守结构性结构域(参见例如，deMaagd等人,(2001)TrendsGenetics[遗传学趋势],17:193-199)。第一保守结构性结构域(称作结构域I)典型地由七个α螺旋组成并且参与膜插入以及孔形成。结构域II典型地由三个布置为希腊钥匙构型的β片层组成，并且结构域III典型地由两个处于“果冻卷”(‘jelly-roll’)构造的反平行的β片层组成(deMaagd等人,2001,同上)。结构域II和III参与受体识别和结合，并且因此被认为是毒素特异性的决定物。众多商业上有价值的植物(包括普通的农作物)易受植物有害生物(包括昆虫和线虫有害生物)的攻击的影响，导致作物产量和品质的实质性降低。例如，植物有害生物是在全世界重要农作物损失中的主要因素。由于昆虫有害生物和疾病，在中国每年收获的谷类损失约15％-20％。此外，由于无脊椎有害生物(包含昆虫)的侵染，仅在美国每年就损失约80亿美元。昆虫有害生物对于菜农和果农，对于观赏性花卉的生产商，以及对于家庭花匠也是负担。昆虫有害生物主要是通过密集施用化学杀有害生物剂来控制，这些化学杀有害生物剂通过抑制昆虫成长、预防昆虫摄食或繁殖、或者导致死亡而有效。生物性有害生物控制剂，如表达杀有害生物毒素(如Cry蛋白)的苏云金芽孢杆菌菌株，也已经施用于作物植物中，产生了令人满意的结果，提供化学杀有害生物剂的替代物或补充物。已经分离了编码这些Cry蛋白中的一些的基因并且它们在异源宿主(如转基因植物)中的表达已经显示出提供了另一种用于控制经济上重要的昆虫有害生物的手段。因此可以达到良好的昆虫控制，但是某些化学品有时也能影响非目标有益昆虫，并且某些生物制剂具有非常窄的活性谱。此外，某些化学和生物控制方法的继续使用增加了昆虫有害生物对此类控制措施产生抗性的机会。通过各种抗性管理实践已部分地缓和了这种状况，但仍需要开发新的并有效的有害生物控制剂，这些有害生物控制剂为农民提供经济利益并且是环境可接受的。特别需要的是可以靶向更广谱的经济上重要的昆虫有害生物并有效控制昆虫品系的控制剂，这些昆虫品系对现有的昆虫控制本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸分子，所述核酸分子包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码对鳞翅目有害生物有毒的Cry蛋白，其中所述核苷酸序列(a)与SEQ ID NO:1-5中任一项或其毒素编码片段具有至少80％到至少99％序列同一性；或者(b)编码如下Cry蛋白，所述Cry蛋白包含与SEQ ID NO:16-25中任一项或其毒素片段具有至少80％到至少99％序列同一性的氨基酸序列；或者(c)是(a)或(b)的组装的核苷酸序列；或者(d)是(a)、(b)或(c)的合成序列，所述合成序列已经进行密码子优化用于在转基因生物中表达。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种核酸分子，所述核酸分子包含如下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码对鳞翅目有害生物有毒的Cry蛋白，其中所述核苷酸序列(a)与SEQIDNO:1-5中任一项或其毒素编码片段具有至少80％到至少99％序列同一性；或者(b)编码如下Cry蛋白，所述Cry蛋白包含与SEQIDNO:16-25中任一项或其毒素片段具有至少80％到至少99％序列同一性的氨基酸序列；或者(c)是(a)或(b)的组装的核苷酸序列；或者(d)是(a)、(b)或(c)的合成序列，所述合成序列已经进行密码子优化用于在转基因生物中表达。


2.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述核苷酸序列包含SEQIDNO:1-5中任一项或其毒素编码片段。


3.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述Cry蛋白包含SEQIDNO:16-25中任一项或其毒素片段的氨基酸序列。


4.如权利要求1所述的核酸分子，其中所述合成核苷酸序列包含SEQIDNO:6-15中任一项或其毒素编码片段。


5.一种嵌合基因，所述嵌合基因包含可操作地连接至如权利要求1-4中任一项所述的核酸分子的异源启动子。


6.如权利要求5所述的嵌合基因，其中所述异源启动子是植物可表达型启动子。


7.如权利要求6所述的嵌合基因，其中所述植物可表达型启动子选自下组启动子，该组由以下组成：泛素、夜香树属黄病毒、玉米TrpA、OsMADS6、玉蜀黍H3组蛋白、噬菌体T3基因95'UTR、玉米蔗糖合成酶1、玉米醇脱氢酶1、玉米捕光复合物、玉米热休克蛋白、玉蜀黍mtl、豌豆小亚基RuBP羧化酶、水稻肌动蛋白、水稻亲环蛋白、Ti质粒甘露碱合酶、Ti质粒胭脂碱合酶、矮牵牛查尔酮异构酶、豆类富甘氨酸蛋白1、马铃薯糖蛋白、凝集素、CaMV35S以及S-E9小亚基RuBP羧化酶启动子。


8.如权利要求5所述的嵌合基因，其中所述鳞翅目有害生物选自下组，该组由以下组成：亚洲玉米蛀虫(亚洲玉米螟)、棉螟蛉(棉铃虫)、欧洲玉米蛀虫(欧洲玉米螟)、以及秋黏虫(草地贪夜蛾)。


9.如权利要求5所述的嵌合基因，其中所述转基因生物是细菌。


10.一种对鳞翅目有害生物有毒的Cry蛋白，并且任选地一种分离的Cry蛋白，其中所述Cry蛋白或分离的Cry蛋白包含(a)与SEQIDNO:16-25中任一项或其毒素片段的氨基酸序列具有至少80％到至少99％序列同一性的氨基酸序列；或者(b)由与SEQIDNO:6-15中任一项或其毒素编码片段的核苷酸序列具有至少80％到至少99％序列同一性的核苷酸序列或组装的核苷酸序列编码的氨基酸序列。


11.如权利要求10所述的Cry蛋白，其中所述氨基酸序列包含SEQIDNO:16-25中任一项或其毒素片段。


12.如权利要求10所述的Cry蛋白，其中所述氨基酸序列由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列包含SEQIDNO:6-15中任一项或其毒素编码片段。


13.如权利要求10-12中任一项所述的Cry蛋白，其中所述鳞翅目有害生物选自下组，该组由以下组成：亚洲玉米蛀虫(亚洲玉米螟)、棉螟蛉(棉铃虫)、欧洲玉米蛀虫(欧洲玉米螟)、以及秋黏虫(草地贪夜蛾)。


14.一种产生如权利要求11所述的Cry蛋白的分离的苏云金芽孢杆菌菌株。


15.一种杀昆虫组合物，所述杀昆虫组合物包含如权利要求10所述的Cry蛋白和农业上可接受的载体。


16.如权利要求15所述的组合物，其中所述农业上可接受的载体选自下组，该组由以下组成：粉剂、尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体以及溶液。


17.如权利要求10所述的组合物，其中所述组合物通过脱水、冷冻干燥、均化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩苏云金芽孢杆菌菌株的培养物而制备。


18.如权利要求17所述的组合物，其中所述苏云金芽孢杆菌菌株是如权利要求14所述的苏云金芽孢杆菌菌株。


19.如权利要求10所述的组合物，其中所述组合物包含产生所述Cry蛋白的转基因细菌细胞。


20.如权利要求10所述的组合物，所述组合物包含按重量计从约1％至约99％的Cry蛋白。


21.一种重组载体，所述重组载体包含如权利要求1所述的核酸分子或如权利要求5所述的嵌合基因。


22.一种转基因细菌细胞或植物细胞，所述转基因细菌细胞或植物细胞包含如权利要求21所述的重组载体。


23.如权利要求22所述的转基因细菌细胞，其中所述细菌细胞是芽孢杆菌属、梭菌属、致病杆菌属、发...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅文倩，K·赛吉恩，M·布拉姆莱特，孙明，
申请(专利权)人：先正达参股股份有限公司，先正达生物科技中国有限公司，华中农业大学，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH