一种应用于动物组织中核酸现场提取方法技术

本发明专利技术属于微生物检测技术领域，尤其涉及一种应用于动物组织中核酸现场提取方法。其中的组织裂解采用的提取试剂为SEMP液、3M醋酸钠、3～8M异硫氰酸胍和Trizol的混合液，体积比为4:1:4:2；漂洗和洗脱时采用核酸吸附材料作为载体。本方法不需要任何复杂的制造或专门的设备(例如移液器、离心机或金属浴等)，可在1～3分钟提取出与标准的商业化核酸提取试剂盒无显著差异的质量浓度核酸；所得的核酸可直接用于LAMP、PCR、RT‑PCR、qRT‑PCR等不同的分子诊断和检测实验。

A method of field extraction of nucleic acids from animal tissues

【技术实现步骤摘要】
一种应用于动物组织中核酸现场提取方法
本专利技术属于微生物检测
，尤其涉及一种应用于动物组织中核酸现场提取方法。
技术介绍
从诊断到基因分型，核酸扩增在世界各地的实验室中已被证明是必不可少的。任何旨在扩增DNA或RNA的应用中的第一步都是从复杂的生物样品中提取核酸，尤其涉及动物组织中核酸的提取；传统上，这项任务需要专门的设备(如离心机、金属浴、磁力架等)，训练有素的技术人员以及多个液体处理步骤。当前核酸分离方法的这种复杂性限制了现阶段实验室环境之外许多DNA扩增技术的使用。由于对更简单、更快速的核酸纯化方法的需求，目前有关核酸提取的商品化试剂盒层出不穷。这些试剂盒中的绝大多数是基于在离液盐存在下核酸与固体二氧化硅支持物的结合；然后，通过一系列洗涤和离心步骤除去污染物，最后在低盐溶液中从二氧化硅洗脱核酸。此外，具有多种旨在捕获和纯化核酸的功能化修饰表面化学物质的超顺磁性氧化硅纳米磁珠也已商业化。磁珠法核酸提取的操作步骤主要包括裂解、结合、洗涤、分离四部分，提取时使用磁力架(或磁铁)将磁珠吸引并固定在试管的侧面，以便在洗涤和洗脱步骤中去除上清液，从而摆脱了对离心机的需要。即使基于磁珠法的核酸纯化相对较快(约20分钟)并且不需要电气设备，但对于在现代实验室环境之外进行的应用(如基于采样现场或附近即刻进行分析)，它仍然过于复杂。本课题组前期基于Cards,WhatmanTM(GEHealthcare,USA)生产的核酸现场提取试剂盒可用于对虾组织核酸的快速提取，整个过程只需10-20分钟，中途无需过柱离心等烦琐步骤，通过直接从核酸吸附材料中扩增核酸而消除了对单独的核酸洗脱步骤的需要。然而，尽管省去了洗脱步骤，但核酸吸附材料需要经70-95℃变性5分钟处理，不但增加了提取时间，而且需要加热设备(如，恒温金属浴)；此外，在用于实时荧光检测实验中，反应管中的核酸吸附材料会影响荧光值的读取，这些再次限制了这一方法在现场检测中的应用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是现有的无论是磁珠法核酸提取还是核酸现场提取试剂盒都存在或是操作复杂，或是提取时间长、需要加热等问题，不能满足对更简单、更快速的核酸纯化方法的需求。为了解决这些问题，我们提供了一种应用于动物组织中核酸现场提取方法，该方法不需要任何复杂的制造或专门的设备(例如移液器、离心机或金属浴等)，可在1～3分钟提取出与标准的商业化核酸提取试剂盒无显著差异的质量浓度核酸；所得的核酸可直接用于LAMP、PCR、RT-PCR、qRT-PCR等不同的分子诊断和检测实验。为达到上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：一种应用于动物组织中核酸现场提取方法，其中的组织裂解采用的提取试剂为SEMP液、3M醋酸钠、3～8M异硫氰酸胍和的混合液，体积比为4:1:4:2；漂洗和洗脱时采用核酸吸附材料作为载体。SEMP液作为样品保存液，可防止样品核酸的降解；3M醋酸钠在核酸提取中，可调节盐离子的浓度，中和核酸分子的负电荷，便于加入乙醇后使DNA沉淀下来；异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质,主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放，提取RNA和DNA；试剂是一种完全的即用型试剂，可用于提取高质量的总RNA或者从各种生物样本中同时提取RNA、DNA和蛋白质。这种酚和异硫氰酸胍单相溶液，可用于提取人、动物、植物、酵母或细菌来源的细胞和组织样本中的纯RNA、DNA和蛋白质。体积比的限定是根据实施例1中不同比例的提取筛选得到的最优体积比。进一步的，所述SEMP液的组成为1MTris·HCl(pH8.0)、700mMEDTA、10％SDS、巯基乙醇、平衡酚和双蒸水，体积比为1:10:10:1:20:58，pH为8.0。Tris·HCl是缓冲液；EDTA是二价阳离子的螯合剂，能抑制酶的活性，pH调至8时才能够完全溶解；SDS可以迅速破坏组织结构，抑制RNase和脱氧核糖核苷酶(DNase)活性，所以SDS也是核酸纯化试剂的关键组分，通常使用10％或者20％的SDS储备液，SDS的工作浓度是0.1-0.5％；巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键；平衡酚适用于分离DNA和RNA。具体包括以下步骤：(1)组织裂解：取适量组织样品(约0.05-0.1g)与提取试剂按一定比例加入至1.5mlEP管(无菌无酶)中采用研磨棒研磨30～90秒；(2)一次漂洗：取采样用核酸吸附材料(直径2～3mm)加入至上述组织研磨管中，用牙签搅动核酸吸附材料使其充分润湿后，挑取至新的1.5mlEP管中，加入100～500μl95％乙醇，更换新牙签轻轻搅动5～15秒；(3)二次漂洗：更换新牙签将上述采样用核酸吸附材料转移到新的1.5mlEP管中，加入100～500μl70％～80％乙醇，搅动核酸吸附材料10～30秒，挑取至滤纸条吸干再适当晾干(约5～15秒)；(4)洗脱核酸：更换新牙签挑取核酸吸附材料至新的0.2mlEP管中，加入10～20μl双蒸水，手指弹动管底10～30秒；溶液即为组织核酸。进一步的，步骤(1)中样本与提取试剂的质量体积(g/ml)比为5:1～5。进一步的，所述采样用核酸吸附材料为WhatmanTMQualitativeFilterPaper:Grade1Circles(GEHealthcare,USA)经打孔器制作成直径2～3mm，能够有效吸附样品裂解液中的核酸。本专利技术进一步提供一种动物组织核酸快速提取试剂盒，包括组分如下表1所示：表1动物组织核酸快速提取试剂盒组分编号名称数量备注1采样用核酸吸附材料4个2样品采集管4个4至-20℃保存3漂洗管A(红盖)4个4漂洗管B(蓝盖)4个5核酸洗脱管4个6研磨棒4个7牙签1包(20支)8吸管4个9手术刀片1个10滤纸条4条11说明书1份进一步的，所述表中样品采集管内预装30～50μl提取试剂；漂洗管A中预装100～500μl95％乙醇；漂洗管B中预装100～500μl70％～80％乙醇；核酸洗脱管中预装10～20μl双蒸水。进一步的，所述动物组织核酸快速提取试剂盒的提取量为4个样本使用量，即4T，样本量可以扩大到8T，16T，32T。与现有技术相比，本专利技术具有以下优势：(1)简单、便携：整个提取过程既不需要吸取液体，也不需要离心，更不需要温浴，完全做到了无设备，而且试剂盒中的所有试管均预装试剂，极大简化了操作复杂性，非常适用于核酸现本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种应用于动物组织中核酸现场提取方法，其特征在于：其中的组织裂解采用的提取试剂为SEMP液、3M醋酸钠、3～8M异硫氰酸胍和Trizol的混合液，体积比为4:1:4:2；漂洗和洗脱时采用核酸吸附材料作为载体。/n

【技术特征摘要】
1.一种应用于动物组织中核酸现场提取方法，其特征在于：其中的组织裂解采用的提取试剂为SEMP液、3M醋酸钠、3～8M异硫氰酸胍和Trizol的混合液，体积比为4:1:4:2；漂洗和洗脱时采用核酸吸附材料作为载体。


2.如权利要求1所述的应用于动物组织中核酸现场提取方法，其特征在于：所述SEMP液的组成为1MpH8.0的Tris·HCl、700mMEDTA、10％SDS、巯基乙醇、平衡酚和双蒸水，体积比为1:10:10:1:20:58，pH为8.0。


3.如权利要求1或2所述的应用于动物组织中核酸现场提取方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)组织裂解：取适量组织样品与提取试剂按一定比例加入至1.5mlEP管中采用研磨棒研磨；
(2)一次漂洗：取采样用核酸吸附材料加入至上述组织研磨管中，用器具搅动核酸吸附材料使其充分润湿后，挑取至新的1.5mlEP管中，加入100～500μl95％乙醇，更换新器具轻轻搅动；
(3)二次漂洗：更换新器具将上述采样用核酸吸附材料转移到新的1.5mlEP管中，加入100～500μl70％～80％乙醇，搅动核酸吸附材料，挑取至滤纸条吸干再适当晾干；
(4)洗脱核酸：更换新器具挑取核酸吸附材料至新的0.2mlEP管中，加入10～20μl双蒸水，弹动管底；溶液即为组织核酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹志，马帅，李金积，黄倢，单虎，郑世磊，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37