一种抗体药物生产工艺中碎片的修复方法技术

本发明专利技术公开了一种基于动力学计算的抗体生产工艺中蛋白药物碎片的修复方法，其基于反应动力学模型的表达式为(13)～(18)，采用该模型可以计算出最优的工艺处理策略。采用该模型可以识别在蛋白质A捕获过程中影响IgG二硫键再氧化的工艺参数，如树脂、温度、酸碱度、电导率和氧化剂，由此，建立了基于再氧化机理的反应动力学定量模型，通过该模型衍生出的二硫键再氧化法，可生产高纯度单克隆抗体；该动力学模型提供了对这些工艺参数的系统理解，以符合美国FDA提出的“质量源于设计(QbD)”的概念来控制产品质量。

A repair method of fragments in the production process of antibody drugs

【技术实现步骤摘要】
一种抗体药物生产工艺中碎片的修复方法
本专利技术涉及抗体药物制备
，尤其是一种抗体药物生产工艺中碎片的修复方法。
技术介绍
蛋白质药物分子结构复杂，相比于传统的化学药物或者小分子药物的生产过程更为复杂，一旦发现发生质量问题，很难进行问题诊断和修复。目前大多数研究都集中在预防上，包括控制收获期间和收获后的溶解氧水平、冷冻收获细胞培养、缩短收获细胞培养保持时间以及添加减少抑制剂。这些预防策略都不能用于减少和挽救被还原导致的碎片化产品。虽然也有通过单一的氧化方法进行修复的报道。但是方法单一，适用面弱，且多为基于经验的操作，而非基于生产工艺问题诊断后的对症方法。重组抗体是一类重要的治疗蛋白，典型的IgG分子量为150kDa，由两条轻链和两条重链组成，由链间二硫键连接。二硫键是稳定蛋白质天然结构的重要因素。不适当的二硫键形成和二硫键还原会影响工艺性能和蛋白质稳定性和功能性。在哺乳动物细胞培养过程中，细胞培养收获后二硫键的还原更为频繁。高还原力导致的还原是由于细胞内成分的释放，如硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶。大多数研究都集中在二硫键减少的预防上，包括控制收获期间和收获后的溶解氧水平、冷冻收获细胞培养、缩短收获细胞培养保持时间以及添加减少抑制剂。这些预防策略都不能用于减少和挽救二硫键被还原导致的碎片化产品。近年来，生物制药的大力发展，蛋白药物二硫键的减少在收获期更为常见。大多数的现有缓解策略是防止二硫化物的还原，而对还原产物的补救办法很少且效果差。
技术实现思路
基于上述问题，本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种可有效补救抗体药物中被还原二硫键的方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种抗体生产工艺中碎片的修复方法，包括如下步骤:(1)构建反应动力学模型，表达式为:根据上述表达式(13)～(18)计算一定的工艺处理时间后，抗体碎片的浓度，其中，k1～k6是每一个基元反应的相应速率常数，L表示IgG轻链、H表示IgG重链、HH表示IgG重重碎片、HL表示IgG半聚体、HHL表示IgG重重轻碎片以及MONO表示IgG完整单体，t表示工艺处理时间，0表示工艺处理之初；(2)使用步骤(1)中动力学模型模拟蛋白药物分子的碎片化和修复过程；(3)将需要研究的各影响因子通过步骤(1)中动力学模型进行分析拟合；(4)根据步骤(3)计算机运算的模型拟合结果推演出最优的蛋白药物分子碎片的修复条件(即工艺参数)并通过实验进行验证，即得。需要说明的是，采用上述检测方法中的动力学模型，可以识别在蛋白质A捕获过程中影响IgG二硫键再氧化的工艺参数【即上述步骤(3)中各影响因子】，如树脂、温度、酸碱度、电导率和氧化剂，进而建立了基于再氧化机理的反应动力学定量模型，通过该模型衍生出的二硫键再氧化法，可生产出高纯度单克隆抗体，该动力学模型提供了对这些工艺参数的系统理解，以通过设计质量的概念来控制产品质量。优选地，所述修复方法包括对所述碎片中断裂的二硫键的再氧化，进行所述氧化反应时溶液中pH为8～10。优选地，所述氧化反应时温度为20～34℃。优选地，所述氧化反应时溶液中半胱氨酸的浓度为1mM。优选地，所述氧化反应时溶液中胱氨酸的浓度为0.3mM。优选地，所述氧化反应时溶液的电导率小于7.3ms/cm。优选地，所述氧化反应时溶液中半胱氨酸的浓度为1mM，胱氨酸的浓度为0.3mM，pH为8，氧化反应温度为20℃，电导率小于7.3ms/cm，溶液中有蛋白A树脂。综上所述，本专利技术的有益效果为：本专利技术提供了一种抗体药物的反应动力学模型，采用该模型可以模拟计算在蛋白质A捕获过程中影响IgG二硫键再氧化的工艺参数，如树脂、温度、酸碱度、电导率和氧化剂，由此，建立了基于动力学模型机理的蛋白质碎片修复二硫键再氧化法。通过此方法可生产高纯度单克隆抗体，修复在生产中出现的蛋白质碎片；该动力学模型提供了对这些工艺参数的系统理解，以通过美国FDA提出的“质量源于设计(QbD)”的概念来控制产品质量。附图说明图1为蛋白碎片修复形成完整蛋白药物的反应机理示意图，其中长条代表重链，短条代表轻链；图2为在碳酸钠(pH8)缓冲液中，含有或不含有蛋白A树脂的IgG再次氧化后完整IgG单体占比结果图，其中点是实验数据，线代表模拟结果；图3是在碳酸钠(pH8)缓冲液中，不同电导率(ms/cm)下的IgG再氧化后完整IgG单体占比结果图，其中(A)无蛋白A树脂；(B)有蛋白A树脂，点代表实验数据，线代表模拟结果；(C)通过方程式(19)模拟选定的在电导不同条件下的动力学参数；动力学和模拟参数见表1；图4是在碳酸钠(pH8)缓冲液中，用蛋白A树脂在不同温度下对IgG进行0.5或1mM半胱氨酸和0.3mM胱氨酸再氧化后完整IgG单体占比结果图，其中(A)半胱氨酸，0.5mM，(B)半胱氨酸，1.0mM，点代表实验数据，线代表模拟结果；(C)不同半胱氨酸浓度下所选动力学参数K3和K6的阿累尼乌斯方程模拟，动力学参数见表3；图5是阿累尼乌斯方程模拟选定的动力学参数K3和K6，以及每种IgG类型的简化结构图，动力学参数见表4；图6是优化条件下的IgG再氧化动力学的分子碎片分布图，其中，条件是1mM半胱氨酸，0.5mM胱氨酸，pH8，20℃下的电导率7.3ms/cm，蛋白A树脂。点代表实验数据，线代表模型计算结果；图7是在优化条件下，从初始纯度29％出发，对IGG进行再氧化动力学预测的分子碎片分布图；图8是在优化条件下，初始纯度14％出发，IgG再氧化动力学的分子碎片分布图，其中点代表实验数据，虚线代表模型预测结果。具体实施方式蛋白质药物分子结构复杂，相比于传统的化学药物或者小分子药物的生产过程更为复杂，一旦发现发生质量问题，很难进行问题诊断和修复。目前大多数研究都集中在预防上，包括控制收获期间和收获后的溶解氧水平、冷冻收获细胞培养、缩短收获细胞培养保持时间以及添加减少抑制剂。这些预防策略都不能用于减少和挽救被还原导致的碎片化产品。虽然也有通过单一的氧化方法进行修复的报道。但是方法单一，适用面弱，且多为基于经验的操作，而非基于生产工艺问题诊断后的对症方法。本专利技术对上述问题进行了系统性的突破，通过一种动力学模型的方法，以识别在蛋白质A捕获过程中影响IgG二硫键再氧化的工艺参数，如树脂、温度、酸碱度、电导率和氧化剂。建立了基于再氧化机理的反应动力学定量模型。通过这一基于问题产生机理的诊断，推演出相应经过优化的二硫键再氧化法，可生产高纯度单克隆抗体。本专利技术首次提供了系统性的从生产工艺问题诊断，机制分析，到解决优化的“一站式”处理方法，很好的结合了数理模型，分子化学特性和工程学的应用。本专利技术提供了一种新的动力学模型用于实施例研究，用于评估在蛋白质A捕获过程中，识别树脂、温度、酸碱度、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗体药物生产工艺中碎片的修复方法，包括如下步骤:/n(1)构建反应动力学模型，表达式为:/n

【技术特征摘要】
1.一种抗体药物生产工艺中碎片的修复方法，包括如下步骤:
(1)构建反应动力学模型，表达式为:


















根据上述表达式(13)～(18)计算一定的工艺处理时间后，抗体碎片的浓度，其中，k1～k6是每一个基元反应的相应速率常数，L表示IgG轻链、H表示IgG重链、HH表示IgG重重碎片、HL表示IgG半聚体、HHL表示IgG重重轻碎片以及MONO表示IgG完整单体，t表示工艺处理时间，0表示工艺处理之初；
(2)使用步骤(1)中动力学模型模拟蛋白药物分子的碎片化和修复过程；
(3)将需要研究的各影响因子通过步骤(1)中动力学模型进行分析拟合；
(4)根据步骤(3)计算机运算的模型拟合结果，推演出最优的蛋白药物分子碎片的...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤培峰，翁永妍，
申请(专利权)人：苏州纽博立科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32