用于生成植物的荧光激活细胞分选(FACS)富集制造技术

本申请提供用于生成植物的荧光激活细胞分选(FACS)富集的方法。具体地，提供一种用于产生包含目标多核苷酸的转基因植物细胞的方法，所述方法包括：通过荧光激活细胞分选(FACS)从一群单个且分别的藻酸钠封装的植物原生质体中分离出包含转基因事件的单个藻酸钠封装的植物原生质体，其中所述转基因事件包含目标多核苷酸和荧光标志物；和培养分离的植物原生质体以产生包含目标多核苷酸的转基因植物细胞。

Enrichment of FACS for plant production

【技术实现步骤摘要】
用于生成植物的荧光激活细胞分选(FACS)富集本申请是2013年9月9日提交的申请号为201380054087.4(PCT申请号为PCT/US2013/058766)、专利技术名称为“用于生成植物的荧光激活细胞分选(FACS)富集”的专利技术专利申请的分案申请。对相关申请的交叉引用本申请要求2012年9月7日提交的、流水号61/697,890的美国临时专利申请的优先权。专利
本公开文本涉及用于生成植物的荧光激活细胞分选的领域。在一个优选实施方案中，本公开文本描述了用于生成可繁殖的、经过编辑的植物的经过编辑的、可再生的原生质体的FACS富集。专利技术背景荧光激活细胞分选仪(FACS)是由Bonner、Sweet、Hulett、Herzenberg、及其他人在二十世纪六十年代晚期专利技术的，用于进行可存活细胞的细胞分选和流式细胞计量术。BectonDickinson免疫细胞计量术系统在二十世纪七十年代早期引入商业性机器。荧光激活细胞分选(FACS)是一种专门化类型的流式细胞计量术。它提供一种方法，基于每个细胞的特定光散射和荧光特征，将生物学细胞的异质混合物分选入两个或更多个容器，一次一个细胞。它是一种有用的科学仪器，因为它提供来自细胞个体的荧光信号的快速、客观且定量记录以及有特定兴趣的细胞的物理分出。细胞悬浮液在较窄、快速流动的液体流的中央带走。流动是安排好的，使得细胞之间相对于它们的直径有较大的分开。振荡机制引起细胞流断成各个小滴。调节系统，使得每个小滴超过一个细胞的概率较低。刚好在液流断成小滴之前，流动穿过荧光测量站，在那里测量每个细胞的感兴趣荧光特征。将一个充电环恰好放置在液流断成小滴的点。根据刚刚之前的荧光强度测量，在环上放置一个电荷，并在自液流断成小滴时在小滴上捕获相反的电荷。然后，带电荷的小滴落入、穿过静电偏转系统，该系统根据小滴的电荷将它们转向入容器。在一些系统中，将电荷直接应用液流，而且小滴中断保留与液流相同符号的电荷。然后，在小滴中断后，液流恢复中性。较宽范围的荧光团可用作流式细胞计量术中的标记物。通常将荧光团(或简称“fluor”)附着于识别细胞上或细胞中的靶特征的抗体；也可以将它们附着于对细胞膜或其它细胞结构具有亲和力的化学实体。每种荧光团具有特征性的峰激发和发射波长，而且发射谱常常交叠。因而，可使用的标记物的组合取决于用于激发荧光染料的灯或激光的波长及可用的检测仪。荧光激活细胞分选(FACS)提供自细胞的异质混合物分离大数目荧光标记细胞的一种快速手段。具有荧光标志物基因诸如绿色荧光蛋白(GFP)的细胞类型特异性表达的转基因植物的收集理想地适合于各种细胞类型的FACS辅助研究。已经证明植物原生质体的流式细胞计量术分析和荧光激活细胞分选(FACS)是可实施的，而且，这种技术已经在许多不同研究领域产生有价值的结果(HarkinsandGalbraith,1984；Galbraithetal.,1995；Sheenetal.,1995)。例如，来自表达组织特异性荧光蛋白标志物的拟南芥植物的原生质体的FACS已经用于检查特定细胞类型中的基础和环境刺激的转录谱二者(Birnbaumetal.,2003；Bradyetal.,2007；Giffordetal.,2008；Dinnenyetal.,2008)，而且流式细胞计量术已经用于分析烟草原生质体中的反应性氧种类生成和程序性细胞死亡(Nicotianatabacum；Linetal.，2006)。有较宽选集的荧光工具可用于研究植物中的众多生理学参数，例如，与荧光蛋白融合的顺式调节元件(HaseloffandSiemering,2006)、遗传编码的分子传感器(Loogeretal.,2005)或基于染料的传感器(Haugland,2002)可以与细胞计量术组合用于测量多种多样的生物学过程。然而，由于测定法的灵敏度，这种方法有某些无效，因此仍有改进的空间。专利技术概述本公开文本的一个特定实施方案涉及一种通过利用目的多核苷酸分离植物原生质体、自一群植物细胞生成植物的方法，该方法通过下述步骤来进行：提供具有至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体的一群植物原生质体，其中该群基本上没有包含荧光标志物且不包含目的多核苷酸的植物原生质体；其中该植物原生质体由藻酸钠封装；自该群中的其余植物原生质体分出至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体，由此分离包含目的多核苷酸的植物原生质体；自所述分离的植物原生质体再生植物；并培养所述植物。在本专利技术的另一个实施方案中，可以是通过分离包含整合入植物原生质体基因组的目的多核苷酸的植物原生质体而再生的植物，这通过下述步骤来进行：提供具有至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体的一群植物原生质体；其中该植物原生质体由藻酸钠封装；自该群包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体回收微愈伤组织，其中该至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体已经用目的多核苷酸和编码荧光标志物的多核苷酸转化；自所述微愈伤组织再生植物；并培养所述植物。备选实施方案包括用于生成转基因植物的方法，该方法可包括提供具有至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体的一群植物原生质体，其中该至少一个原生质体包含位点特异性核酸酶，使得目的多核苷酸能够通过位点特异性核酸酶的识别位点处的同源重组整合在至少一个植物原生质体的基因组中且其中该植物原生质体由藻酸钠封装；自该群中的其余植物原生质体分出至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体；自至少一个原生质体再生转基因植物；并培养所述转基因植物。具体而言，本申请提供以下各项：1.一种包括分离包含目的多核苷酸的植物原生质体、自一群植物细胞生成植物的方法，该方法包括：提供具有至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体的一群植物原生质体，其中该群基本上没有包含荧光标志物且不包含目的多核苷酸的植物原生质体；其中该植物原生质体由藻酸钠封装；自该群中的其余植物原生质体分出至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体，由此分离包含目的多核苷酸的植物原生质体；自所述分离的植物原生质体再生植物；并培养所述植物。2.依照项1的方法，其中分出至少一个原生质体包括利用流式细胞术。3.依照项1的方法，其中分出至少一个原生质体包括利用荧光激活细胞分选(FACS)。4.依照项1的方法，其中荧光标志物为自植物原生质体中的多核苷酸表达的荧光多肽。5.依照项1的方法，其中目的多核苷酸编码目的多肽。6.依照项5的方法，其中目的多肽为锌指核酸酶。7.依照项1的方法，其中该群植物原生质体得自植物组织。8.依照项1的方法，其包括分出包含目的多核苷酸和荧光标志物的多数原生质体。9.依照项1的方法，其中植物为单子叶植物或双子叶植物。10.通过分离包含整合入植物原生质体基因组的目的多核苷酸的植物原生质体再生的植物，该方法包括：提供具有至少一个包含目的多核苷酸和荧光标志物的原生质体的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于产生包含目标多核苷酸的转基因植物细胞的方法，所述方法包括：/n通过荧光激活细胞分选(FACS)从一群单个且分别的藻酸钠封装的植物原生质体中分离出包含转基因事件的单个藻酸钠封装的植物原生质体，其中所述转基因事件包含目标多核苷酸和荧光标志物；和/n培养分离的植物原生质体以产生包含目标多核苷酸的转基因植物细胞。/n

【技术特征摘要】
20120907 US 61/697,890;20130906 US 14/020,6941.一种用于产生包含目标多核苷酸的转基因植物细胞的方法，所述方法包括：
通过荧光激活细胞分选(FACS)从一群单个且分别的藻酸钠封装的植物原生质体中分离出包含转基因事件的单个藻酸钠封装的植物原生质体，其中所述转基因事件包含目标多核苷酸和荧光标志物；和
培养分离的植物原生质体以产生包含目标多核苷酸的转基因植物细胞。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标多核苷酸编码多肽。


3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其包括分离多个包含目标多核苷酸和荧光标志物的藻酸钠封装的原生质体。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中包含转基因事件的单个藻酸钠封装的植物原生质体是通过使用直径大于100μm的喷嘴和小于20psi的外鞘压力进行FAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·斯潘根伯格，S·萨哈布，J·梅森，
申请(专利权)人：美国陶氏益农公司，
类型：发明
国别省市：美国;US