一种WRI3/4基因、克隆方法及其应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，尤其涉及一种油莎豆WRI3/4基因、克隆方法及其应用。所述油莎豆WRI3/4基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；其编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或其编码氨基酸序列为与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有90％以上同源性且表达同等功能的氨基酸序列。所述油莎豆WRI3/4基因的克隆方法为：以油莎豆为材料，根据高等植物WRI基因保守区段序列设计简并引物，扩增油莎豆WRI基因保守区段，然后进行5’‑RACE和3’‑RACE，得到油莎豆5’端和3’端序列；根据油莎豆5’端和3’端序列设计全长序列引物，扩增，即得到油莎豆WRI3/4基因。

A wri3 / 4 gene, cloning method and its application

【技术实现步骤摘要】
一种WRI3/4基因、克隆方法及其应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种油莎豆WRI3/4基因、克隆方法及其应用。
技术介绍
油莎豆，又名虎坚果、铁荸荠、地下核桃，是适合生长在沙地的莎草科一年生块茎类植物。油莎豆耐旱、耐涝、耐贫瘠、耐盐碱，在沙质土、白浆土、盐碱地、黑土及荒地山坡等各种土质的地方均能生长，无论土地肥力高低，均可种植，最适合沙壤土、喜钾肥。因此，开发利用油莎豆的抗旱基因在抗旱植物培育的实际应用中具有很高的研究价值。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种油莎豆WRI3/4基因、克隆方法及其在培育植物抗旱种质上的应用方法。本专利技术提供一种油莎豆WRI3/4基因，所述油莎豆WRI3/4基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其编码氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，或其编码氨基酸序列为与SEQIDNo.2所示的氨基酸序列具有90％以上同源性且表达同等功能的氨基酸序列。本专利技术还提供了包含上述油莎豆WRI3/4基因的重组载体。本专利技术还提供了包含上述重组载体的转化体。本专利技术还提供了上述油莎豆WRI3/4基因的克隆方法，包括以下步骤：以油莎豆为材料，根据高等植物WRI基因保守区段序列设计简并引物，扩增油莎豆WRI基因保守区段，然后进行5’-RACE和3’-RACE，得到油莎豆5’端和3’端序列；根据油莎豆5’端和3’端序列设计全长序列引物，扩增，即得到油莎豆WRI3/4基因。进一步地，根据高等植物WRI基因保守区段序列设计的简并引物序列为：degenerateFP：5‘-GGTTCGAGGCCCACYTNTGGGAYAA；degenerateRP：5‘-TCGATGGCGGCCADRTCRTANGC；根据油莎豆5’端和3’端序列设计的全长序列引物为：WRI3/4fulllengthFP：5‘-TCCCCTCTCGTTTTAGCTCTCCTTCATTTC；WRI3/4fulllengthRP：5‘-GGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC。本专利技术提供的油莎豆WRI3/4基因能够应用于培育植物抗旱种质。进一步地，利用油莎豆WRI3/4基因培育植物抗旱种质的方法为：S1，载体构建：将油莎豆WRI3/4基因和植物表达载体质粒进行酶切、连接，转化大肠杆菌，筛选鉴定重组子，获得超量表达载体；S2，植物转基因：利用带有超量表达载体质粒的农杆菌转化待培育植物，收获T1代种子，T1代种子萌发后进行PCR鉴定，阳性植株自交获得T2代种子，T2代种子萌发后进行PCR鉴定，阳性植株自交获得纯合T3代转基因种子。进一步地，步骤S2中，载体构建的具体过程为：利用PstI和SalI将油莎豆WRI3/4基因和pCambia2300-35S-nos载体质粒酶切，连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选鉴定重组子，获得超量表达载体pCambia2300-35S-CeWRI3/4-nos。进一步地，所述农杆菌为农杆菌EHA105。进一步地，所述待培育植物包含但不限于拟南芥。进一步地，步骤S2中，进行PCR鉴定的引物序列为：NPTIIFP：5‘-CCGGCCGCTTGGGTGGAGAGG；NPTIIRP：5‘-CGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTC。本专利技术提供的技术方案带来的有益效果是：本专利技术提供了一种油莎豆WRI3/4基因，该油莎豆WRI3/4基因对于培育植物抗旱种质具有重要的研究意义。培育的转基因植株通过促进脂肪酸和蜡质合成基因表达，增强植株表面蜡质含量从而提高抗旱性。附图说明图1为不同植物双AP2结构域基因的进化关系图。图2为利用NPTII引物鉴定转基因拟南芥的示意图。图3A为无PEG胁迫条件下10天大小的野生型(WT)和转基因拟南芥株系B1和K2幼苗(上)和5％PEG胁迫条件下14天大小的野生型(WT)和转基因拟南芥株系B1和K2幼苗(下)；图3B为野生型和转基因拟南芥株系的鲜重变化示意图；图3C为野生型和转基因拟南芥株系的主根长变化示意图。图4为野生型(WT)和转基因株系B1、K2的植株形态示意图。图5分别为断水15天后野生型(WT)和转基因株系B1、K2的萎蔫频率(左)，断水22天复水1天后野生型(WT)和转基因株系B1、K2的复活频率(右)结果图。图6为野生型(WT)和转基因拟南芥株系A5、A7、B1、K2脂肪酸和蜡质合成相关基因的荧光定量PCR结果示意图。图7为野生型(WT)和转基因拟南芥株系A5、A7、B1和K2断水胁迫后的生理指标示意图。图8为野生型(WT)和转基因株系B1和K2叶片中的蜡质组成和含量结果图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术实施方式作进一步地描述。本专利技术的实施例提供了一种油莎豆WRI3/4基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其相应的编码氨基酸序列如SEQIDNo.2所示,或其编码氨基酸序列为与SEQIDNo.2所示的氨基酸序列具有90％以上同源性且表达同等功能的氨基酸序列。油莎豆WRI3/4基因的基因克隆步骤为：以实验室保存的油莎豆品系hubu-1为材料，根据高等植物WRI基因保守区段序列设计简并引物，扩增油莎豆WRI基因保守区段；在此基础上进行5’-RACE和3’-RACE，得到油莎豆5’端和3’端序列；根据油莎豆5’端和3’端序列设计全长序列引物，扩增得到油莎豆WRI基因全长序列。其中，根据高等植物WRI基因保守区段序列设计的简并引物序列为：degenerateFP：5‘-GGTTCGAGGCCCACYTNTGGGAYAA；degenerateRP：5‘-TCGATGGCGGCCADRTCRTANGC；5’-RACE引物序列为：5‘-CGGCGGCTTCTTCTTCTGTTGCGTATG；3’-RACE引物序列为：5‘-TTGGGATAAGAACAGTTGGAATGAGAC；根据油莎豆5’端和3’端序列设计的全长序列引物为：WRI3/4fulllengthFP：5‘-TCCCCTCTCGTTTTAGCTCTCCTTCATTTC；WRI3/4fulllengthRP：5‘-GGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC。序列分析：通过NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)对获得的油莎豆WRI基因全长序列进行保守结构域分析，发现该基因带有2个AP2/ERF结构域，属于AP2家族基因；进一步利用MEGA7.0软件对不同植物AP2家族基因进行聚类分析，发现所得油莎豆WRI基因与WRI3和WRI4聚在一起(见图1)，因此命名为油莎豆WRI3/4基因，记为CeWRI3/4。上述油莎豆WRI3/4基因能够用来培育本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种油莎豆WRI3/4基因，其特征在于，所述油莎豆WRI3/4基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示；其编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或其编码氨基酸序列为与SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列具有90％以上同源性且表达同等功能的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种油莎豆WRI3/4基因，其特征在于，所述油莎豆WRI3/4基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；其编码氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，或其编码氨基酸序列为与SEQIDNo.2所示的氨基酸序列具有90％以上同源性且表达同等功能的氨基酸序列。


2.包含权利要求1所述油莎豆WRI3/4基因的重组载体。


3.包含权利要求2所述重组载体的转化体。


4.权利要求1所述油莎豆WRI3/4基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：以油莎豆为材料，根据高等植物WRI基因保守区段序列设计简并引物，扩增油莎豆WRI基因保守区段，然后进行5’-RACE和3’-RACE，得到油莎豆5’端和3’端序列；根据油莎豆5’端和3’端序列设计全长序列引物，扩增，即得到油莎豆WRI3/4基因。


5.根据权利要求4所述的油莎豆WRI3/4基因的克隆方法，其特征在于，根据高等植物WRI基因保守区段序列设计的简并引物序列为：
degenerateFP：5‘-GGTTCGAGGCCCACYTNTGGGAYAA；
degenerateRP：5‘-TCGATGGCGGCCADRTCRTANGC；
根据油莎豆5’端和3’端序列设计的全长序列引物为：
WRI3/4fulllengthFP：5‘-TCCCCTCTCGTTTTAGCTCTCCTTC...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄邦全，程超，韩昀，夏迪，胡书同，黄邦连，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42