一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法技术

本发明专利技术一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，包括以下步骤：振荡消化肿瘤组织，制备混合细胞悬液；将混合细胞悬液沿离心管壁缓慢加入到胎牛血清上层，加完后放置到培养箱中静置；时间差异消化贴壁细胞，获得纯度高的原代肿瘤细胞。本发明专利技术提供的高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，采用振荡器对组织团块进行消化，可加速组织团块分散成单个细胞悬液，减少混合消化酶对细胞膜的破坏，即提高接种细胞的存活率，又能保护原代细胞膜的特性，利用胎牛血清静置沉淀加时间差异胰酶消化实现原代肿瘤细胞的纯化，可将肿瘤细胞和其他非肿瘤细胞进行最大程度的分离，纯化效率高，节约纯化时间，既简单又实用，为应用到临床病人的个体化治疗提供重要的技术支持。

A rapid purification method of high purity primary tumor cells

【技术实现步骤摘要】
一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法
本专利技术属于原代肿瘤细胞纯化
，具体涉及一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法。
技术介绍
当今社会，癌症作为威胁人类健康的重要疾病之一，其发病率和死亡率高居不下。由于肿瘤细胞的特异性表征很难寻找，在现有的科学研究中还未能找到一种针对癌症的特异性治疗药物。原代肿瘤细胞培养方法，指在无菌条件下，从动物体内提取组织，通过体外模拟体内生理环境使其生存和生长并维持其结构以及功能的方法，其作为癌症体外研究的重要手段，可为肿瘤的深入研究及治疗提供有效的细胞来源，与体内研究相辅相成。若能从病人肿瘤组织中纯化出原代肿瘤细胞并通过药物筛选出对该原代肿瘤细胞杀伤力最强的药物，再用于该病人的治疗，将大大提高该病人的癌症治疗率。1951年人类第一株肿瘤细胞Hela(宫颈癌)的建立对癌症的研究产生了重大的影响，极大促进了各种癌症治疗方法的发展。但是，现有的肿瘤细胞原代培养成功率并不高，且耗费时间长，待肿瘤细胞稳定生长时，已失去了很多该肿瘤组织所特有的生物学特性，因此，我们仍需进一步探讨与研究如何缩短原代肿瘤细胞纯化及培养时间，保证其形状与体内相似，为研究肿瘤发生、发展及转移机制以及抗肿瘤药物敏感性的检测甚至肿瘤的基因治疗提供一个有效的平台。尽管建立肿瘤细胞系的技术方法在不断改进，但是仍没有一种高效率、规范化的建立方法，现有的细胞纯化方法主要分为两种：自然纯化和人工纯化。自然纯化作为最早的一种纯化方式，利用某一种类细胞的增殖优势，在长期传代过程中自然淘汰劣势细胞，仅留下生长旺盛的细胞以实现细胞纯化，但是此方法花费时间长，留下来的几乎都是成纤维细胞，仅有恶变的肿瘤细胞或突变的细胞能通过此方法保留下来，而且需要不断纯化才能达到建立细胞系的标准，培养时间过长会影响原代肿瘤细胞的细胞学特性，影响其生物学特性的研究。人工纯化借助人为技术创造对某一种类细胞生长有利的生存环境，实现细胞的纯化，目前主要通过以下几种方法来实现：酶消化法、机械刮除法和克隆法等，但都存在以下不足：酶消化法通常使用胰蛋白酶，该酶作用于精氨酸及赖氨酸组成的肽键，消化能力非常强，但是对细胞膜的伤害较大，大大影响肿瘤细胞膜表面的生物学特性的研究；机械刮除法是在显微镜下将肿瘤细胞团以外的成纤维细胞团及其他细胞团直接刮除掉，但是该方法对操作人员的工作经验有较高要求，需要操作人员对细胞的生长有深入的研究，并能通过经验判断不同的细胞群，人为误差较大；克隆法将混合细胞分成若干细胞悬液，通过对不同克隆细胞群的检验得到实验所需的肿瘤细胞克隆群，该方法得到的细胞克隆非常纯，但是耗费时间长，在长期的培养过程中，肿瘤细胞的生物学特性与刚离体的肿瘤细胞差异明显，影响研究的准确性。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术手段为：一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，包括以下步骤：步骤一、制备混合细胞悬液取新鲜离体的肿瘤组织，剪碎，加入含胶原酶Ⅰ的DMEM不完全培养基，将混合液转移到离心管中，振荡消化肿瘤细胞，随后离心3-5次，离心后弃上清液；使用胰蛋白酶振荡消化，再用DMEM完全培养基终止消化，经过滤、离心后，弃上清液，加入4℃的PBS振荡混匀，制成混合细胞悬液；步骤二、胎牛血清分离肿瘤细胞取新离心管，加入胎牛血清，将步骤一得到的混合细胞悬液沿离心管壁缓慢加入到胎牛血清的上层，混合细胞悬液不能进入胎牛血清内，加完后放置到培养箱中静置10-20min；步骤三、差异消化获得纯化肿瘤细胞吸取步骤二离心管管底的细胞悬液，经离心后加入1640完全培养基，在六孔板内进行细胞培养，培养2-4天后吸走培养基，加入胰蛋白酶差异消化10-20s，吸走胰蛋白酶，吹打、冲洗六孔板，离心吹打得到的冲洗液得到新的细胞悬液，进行继续培养，重复多次，获得所需纯化原代肿瘤细胞。进一步的，步骤一中，将接种人肺腺癌A549的荷瘤小鼠颈椎脱臼处死，泡于75％酒精4-6min；在细胞间的超净台内用剪刀剪开裸鼠皮肤，在不出血情况下分离出肿瘤组织，离体的肿瘤组织浸泡于0.01MPBS中，并剪碎，加入10-15mL含10mg胶原酶Ⅰ的DMEM不完全培养基，吹散肿瘤组织，把混合液转移到离心管中，使用振荡器振荡消化3-5min，然后放于37℃水浴锅1-2min，循环10-15次，随后离心，弃上清液，加入15-20mL0.01MPBS，振荡混匀，离心，弃上清液，重复离心2-3次。进一步的，步骤一中，加入5-10mL胰蛋白酶，使用振荡器振荡消化5-10min，加入30-40mLDMEM完全培养基终止消化，吹匀后将离心管中的液体倒入80目的筛子过滤，过滤后的液体转移到新离心管中，离心，弃上清液，加入15-20mL0.01MPBS，振荡混匀，离心，弃上清液，重复3-5次，加入5-10mL、4℃的0.01MPBS振荡混匀，制成混合细胞悬液。进一步的，所述胰蛋白酶为：NaCl0.08g、NaHCO30.005g、葡萄糖0.01g、EDTA0.003g、胰蛋白酶0.025g和DDH2O10g。进一步的，所述DMEM完全培养基为：体积百分比10％的胎牛血清、体积百分比89％的DMEM不完全培养基和体积百分比1％的P/S。进一步的，步骤二中，取一新离心管，加入胎牛血清5-15mL，吸取步骤一得到的混合细胞悬液，将混合细胞悬液沿离心管壁缓慢加入到胎牛血清液体的上层，加完后放置到37℃培养箱中静置10-20min。进一步的，步骤三中，吸取离心管管底的细胞悬液1-2mL，挪到新离心管中，加入15-20mL0.01MPBS，振荡混匀，离心，弃上清液，向离心管中加入1640完全培养基，吹打混匀，再采用六孔板进行细胞培养，培养2-4天后吸走培养基，用0.01MPBS吹洗六孔板，再加入4℃胰蛋白酶消化10-20s，吸走胰蛋白酶，用0.01MPBS冲洗六孔板，得到冲洗液，离心冲洗液，对其中的细胞进行继续培养，获得纯化后的原代肿瘤细胞。进一步的，所述1640完全培养基为：体积百分比10％的胎牛血清、体积百分比89％的1640不完全培养基和体积百分比1％的P/S。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术公开了一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，包括以下步骤：步骤一、制备混合细胞悬液；步骤二、胎牛血清分离肿瘤细胞：取新离心管，加入5-15mL胎牛血清，将步骤一得到的混合细胞悬液沿离心管壁缓慢加入到胎牛血清的上层，混合细胞悬液不能加入到胎牛血清内，加完后放置到37℃培养箱中静置10-20min；步骤三、差异消化获得纯化原代肿瘤细胞。本专利技术提供的高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，采用振荡器对肿瘤组织团块进行消化，可以加速肿瘤组织团块分散成单个细胞悬液，这种消化方式可以减少混合消化酶对细胞膜的破坏，即提高接种细胞的存活率，又能保护原代细胞膜的特性，利用胎牛血清静置沉淀联合差异胰蛋白酶消化实现原代肿瘤细胞的纯化，可将肿瘤细胞和其他非肿瘤细胞进行最大程本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤一、制备混合细胞悬液/n取新鲜离体的肿瘤组织，剪碎，加入含胶原酶Ⅰ的DMEM不完全培养基，将混合液转移到离心管中，振荡消化肿瘤细胞，经离心后弃上清液；使用胰蛋白酶振荡消化，再用DMEM完全培养基终止消化，经过滤、离心后，弃上清液，加入4℃的PBS振荡混匀，制成所需混合细胞悬液；/n步骤二、胎牛血清分离肿瘤细胞/n取新离心管，加入胎牛血清，将步骤一得到的混合细胞悬液沿离心管壁缓慢加入到胎牛血清的上层，混合细胞悬液不能进入胎牛血清内，加完后放置到培养箱中静置10-20min；/n步骤三、时间差异消化纯化肿瘤细胞/n吸取步骤二离心管管底的细胞悬液，经离心后加入1640完全培养基，进行细胞培养，培养2-4天后吸走培养基，加入胰蛋白酶差异消化10-20s，吸走胰蛋白酶，离心吹打得到的冲洗液得到新的细胞悬液，继续进行培养，获得所需纯化原代肿瘤细胞。/n

【技术特征摘要】
1.一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、制备混合细胞悬液
取新鲜离体的肿瘤组织，剪碎，加入含胶原酶Ⅰ的DMEM不完全培养基，将混合液转移到离心管中，振荡消化肿瘤细胞，经离心后弃上清液；使用胰蛋白酶振荡消化，再用DMEM完全培养基终止消化，经过滤、离心后，弃上清液，加入4℃的PBS振荡混匀，制成所需混合细胞悬液；
步骤二、胎牛血清分离肿瘤细胞
取新离心管，加入胎牛血清，将步骤一得到的混合细胞悬液沿离心管壁缓慢加入到胎牛血清的上层，混合细胞悬液不能进入胎牛血清内，加完后放置到培养箱中静置10-20min；
步骤三、时间差异消化纯化肿瘤细胞
吸取步骤二离心管管底的细胞悬液，经离心后加入1640完全培养基，进行细胞培养，培养2-4天后吸走培养基，加入胰蛋白酶差异消化10-20s，吸走胰蛋白酶，离心吹打得到的冲洗液得到新的细胞悬液，继续进行培养，获得所需纯化原代肿瘤细胞。


2.根据权利要求1所述的一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，其特征在于，步骤一中，将接种人肺腺癌A549的荷瘤小鼠颈椎脱臼处死，泡于75％酒精4-6min；在细胞间的超净台内用剪刀剪开裸鼠皮肤，在不出血情况下分离出肿瘤组织，离体的肿瘤组织浸泡于0.01MPBS中，并剪碎，加入10-15mL含10mg胶原酶Ⅰ的DMEM不完全培养基，吹散肿瘤组织，把混合液转移到离心管中，使用振荡器振荡消化3-5min，然后放于37℃水浴锅1-2min，循环10-15次，随后离心，弃上清液，再加入15-20mL0.01MPBS，振荡混匀，离心，弃上清液，重复离心2-3次。


3.根据权利要求1所述的一种高纯原代肿瘤细胞的快速纯化方法，其特征在于，步骤一中，加入5-10mL胰蛋白酶，使用振荡器振荡消化5-10min，加入30-40mLDMEM完全培养基终止消化，吹匀后将离心管中的液体倒入...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛琦淇，张谢，仇骞慧，李宏，
申请(专利权)人：宁波市医疗中心李惠利医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33