一株解淀粉芽孢杆菌TBA03及其应用制造技术

本发明专利技术提供一株解淀粉芽孢杆菌TBA03及其应用，属于微生物和生物防治技术领域。所述解淀粉芽孢杆菌TBA03的分类命名为解淀粉芽孢杆菌(

A strain of Bacillus amylolyticus tba03 and its application

【技术实现步骤摘要】
一株解淀粉芽孢杆菌TBA03及其应用
本专利技术属于微生物和生物防治
，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌TBA03及其应用。
技术介绍
烟草是一种叶用经济作物。中国作为烟草生产大国，烟草种植面积、产量和销量均位居世界首位。烟草是一种忌连作的作物，如果在同一片耕地上连续种植烟草，会带来产量降低、烟叶品质变劣和生育状况变差的现象，严重影响了烟草的产量和质量。据统计，每年由于烟草连作带来的直接及间接经济损失高达40亿元人民币，严重威胁到我国烟业的可持续发展。所以，如何缓解烟草连作障碍是当前亟待解决的重要问题，成为国内外同行研究的热点。当前国内外对于烟草连作障碍的治理主要采用化学试剂法、轮作和间套作法和微生物消减法。往连作烟草土壤中添加肥料等化学试剂具有速效、方便、经济效益高等优点，但是有效期短，过量或长期使用会污染环境，影响植物品质；轮作和间套作法对消减连作障碍有着不可忽视的作用，但由于土壤资源匮乏，该方法目前很少应用；微生物消减法通过从土壤中筛选并添加有益微生物，抑制有害微生物生长，改善烟草生长性状，减轻烟草病害，具有环保、生态、安全等优点。据报导，土壤微生物结构是影响烟草病害、导致烟草连作障碍的重要因素之一。利用拮抗菌进行植物病害防治被认为是一种科学、合理、高效、环境友好型的措施。本专利技术的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)TBA03能显著抑制烟草土壤中青枯雷尔氏病原菌的生长，可达到缓解烟草青枯病害的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株解淀粉芽孢杆菌菌株TBA03及其在缓解烟草青枯病病害中的应用。研究表明，本专利技术的解淀粉芽孢杆菌菌株TBA03在接种浓度为4.0×108CFU/kg风干土壤时，能够达到显著缓解烟草青枯病害的目的。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一株解淀粉芽孢杆菌TBA03，其分类命名为：解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，该菌株于2019年12月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCCNO.19108，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该菌株为青枯雷尔氏病原菌的拮抗菌。一株解淀粉芽孢杆菌TBA03在防治烟草青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)中的应用。一种含上述一株解淀粉芽孢杆菌TBA03的微生物制剂。一种含上述一株解淀粉芽孢杆菌TBA03的微生物制剂在防治烟草青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)中的应用。解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)TBA03的筛选方案参见图1。先采集中国云南省玉溪市富良棚乡30年连作烤烟K326根际土壤，通过高通量测序并分析，获得连作烟草土壤病原菌为青枯病菌（Ralstonia）。接着，采用青枯病菌选择性培养基(SMSA培养基)，富集培养青枯雷尔氏病原菌。设计了青枯雷尔氏病原菌特异性引物，进行PCR扩增后，获得纯的青枯雷尔氏病原菌，再添加到常规水稻土壤中，验证青枯雷尔氏病原菌对烤烟K326幼苗的致病性，获得具有导致烟草青枯病害的青枯雷尔氏病原菌，再采用平板对峙法，筛选出对青枯雷尔氏病原菌具有最佳拮抗作用的拮抗菌，并对筛选出的拮抗菌做形态学和16S核榶体RNA基因(16SrDNA)等相关鉴定工作，最终得到解淀粉芽孢杆菌TBA03。具体步骤如下：(1)土壤采集：2018年08月底，分别采集云南省玉溪市富良棚乡30年连作烤烟K326根际土壤和烟区附近未植烟的对照土壤，采用四分法缩分土壤样品，将采集的土壤样品保存于-80℃冰箱中，备接下来的土壤微生物群落结构多样性分析和病原菌筛选使用。(2)土壤微生物群落结构多样性分析：分别提取未植烟对照土壤(CS)和连作烤烟根际土壤(CCS)的基因组DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的纯度和浓度，使用带有Barcode的特异性引物(341F:CCTAYGGGRBGCASCAG和543R:ATTACCGCGGCTGCTGG)，进行CS和CCS基因组DNA的PCR扩增。DNA样本送至北京奥维森基因科技有限公司，利用IlluminaMiseqPE300高通量测序平台测序，微生物多样性检测选取细菌16SrDNAV3-V4区。测序结果表明，青枯雷尔氏菌是菌群数量较高、导致该地区烟草连作障碍的重要病原菌。(3)青枯雷尔氏病原菌富集、分离和纯化：称取10g云南省玉溪市富良棚乡30年连作烤烟K326根际土壤，溶于装有90mL无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得10-1稀释液。取10mL10-1稀释度的土壤悬浮液至另一瓶90mL无菌水的三角瓶中，充分振荡摇匀，得10-2稀释液，依次稀释得10-3稀释液。吸取50µL10-3稀释度的土壤稀释液，涂布到SMSA选择性培养基上，置于30℃恒温培养箱中，培养72h。待培养基上长出清晰可挑选的细菌菌落时，将SMSA固体培养基上清晰可见的细菌菌落挑至装有1mLSMSA液体培养基的离心管中，30℃摇床(200rpm)过夜培养，置于4℃冰箱中，保存备用。SMSA培养基参照ElphinstoneJG等的配方进行配制(ElphinstoneJG.,HennessyJ.,WilsonJK.,SteadDE.SensitivityofdifferentmethodsforthedetectionofRalstoniasolanacearuminpotatotuberextracts.EppoBulletin,1996,26,663-678)。SMSA培养基配制：称取10g蛋白胨和lg酪蛋白氨基酸，加入5mL甘油和995mL18.2MΩ超纯水，制得1L液体培养基。若配制固体培养基，每1L液体培养基中需加入15g琼脂。121℃高压灭菌15min，冷却至50℃后，每升培养基中加入25mg杆菌肽(1250U)、100mg多粘菌素B硫酸盐(600000U)、0.5mg青霉素(825U)、5mg氯霉素、5mg结晶紫和50mg2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)。(4)青枯雷尔氏病原菌鉴定：参照KubotaR等的描述(KubotaR.,VineBG.,AlvarezAM.,JenkinsDM.DetectionofRalstoniasolanacearumbyLoop-MediatedIsothermalAmplification[J].Phytopathology,2008,98,1045)，设计青枯雷尔氏菌flic致病基因的特异性引物(F:5′-TGGCGGTTGCGGTCTA-3′和R:5′-GATCAGGTCTTCCGGCTCTA-3′)，PCR扩增flic基因。PCR扩增体系(20μL)为：TaqPCRMasterMix10μL，上下游引物各1μL，无菌水5μL，DNA模板3μL。扩增程序为：95°C预变性5min，95°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸1min，30个循环，继续72°本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株解淀粉芽孢杆菌TBA03，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌TBA03的分类命名为解淀粉芽孢杆菌(

【技术特征摘要】
1.一株解淀粉芽孢杆菌TBA03，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌TBA03的分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，该菌株于2019年12月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCCNO.19108。


2.如权利要求1所述的一株解淀...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨桂娣，陈伟，陈雨曦，林文雄，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35