PD-L1纳米抗体、制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于抗体技术领域，公开了一种PD‑L1纳米抗体、制备方法及其应用，设计合成引物2条，通过PCR的方法扩增出足够量的目的产物换载酶切，目的片段与载体连接，转化，筛选克隆；蛋白鉴定表达；构建抗体库；选用M13噬菌体展示系统展示VHH抗体文库，该系统由pMECS噬菌粒载体、E.coli TG1和M13KO7辅助噬菌体组成。本发明专利技术在噬菌粒载体pMECS中，Pst I酶切位点之前的序列为pelB分泌信号肽和抗体第一个框架区部分氨基酸的编码序列，pelB信号肽能够将后续多肽引导分泌至周质腔；Not I酶切位点之后是HA和6×His标签的编码序列，可用于融合蛋白的纯化或检测。

PD-L1 nano antibody, preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
PD-L1纳米抗体、制备方法及其应用
本专利技术属于抗体
，尤其涉及一种PD-L1纳米抗体、制备方法及其应用。
技术介绍
目前，已有一些抗PD-L1的单克隆抗体获批用于癌症的治疗。例如PD-L1抑制剂Tecentriq(Atezolizumab或称MDL3280a)，批准适应症为膀胱癌(尿路上皮癌)。PD-L1在绝大多数肿瘤组织中表达增高，例如乳腺癌、非小细胞肺癌和黑色素瘤等，PD-L1在肿瘤细胞中的表达也被认为是许多类型的恶性肿瘤的预后因素。为了阻断PD-L1与受体PD1结合，抑制肿瘤发展，免疫治疗抗体药物的研发也非常迅速，opdivo、keytruda、Atezolizumab等知名药物也有着显著效果。因此，在使用这些药物前，进行PD-L1基因解码基因检测是非常有必要的。同济大学医学院肿瘤研究所所长，上海市肺科医院周彩存教授指出，当前的临床试验证据显示，PD-1免疫检查点抑制剂如帕博利珠单抗，在作为单药一线，或联合标准化疗治疗无EGFR/ALK基因突变的非小细胞肺癌时，都显示了比单纯的标准化疗更好的疗效，为病人带来了更显著的生存获益。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为PD-L1纳米抗体，其序列为SEQ ID NO：1，DNA序列为：/nCGGGGCGGGAACATTTCCAAGCTTAAGGAGACAGTACATATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATT/nACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGA/nGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGAAACGATGTCATGGCCTGGTTCCGCCAGATTCCAGGGAAGGAGCG...

【技术特征摘要】
20190705 CN 20191060422501.一种纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为PD-L1纳米抗体，其序列为SEQIDNO：1，DNA序列为：
CGGGGCGGGAACATTTCCAAGCTTAAGGAGACAGTACATATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATT
ACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGA
GACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGAAACGATGTCATGGCCTGGTTCCGCCAGATTCCAGGGAAGGAGCGT
GAGTTTGTTGCGGTGATTGCCTACGATGCGGCTGACACAGACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCATCATCTCCAG
AGACAACGCCAAGAACACGATATATTTGCAAATGAACACCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGCCG
ACAAGGACAGAATGTACGGTAGTAGGCACTGGCCGGAATATGAGTATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTC
TCCTCAGCGGCCGCATACCCGTACGACGTTCCGGACTACGGTTCCCACCACCATCACCATCACTAGACTGTTGAAAGTTG
TTTAGCAAAACCTCATACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAGATCGTTACGCTAACTATG
AGGGCTGTCTGTGGAATGCTACAGGCGTTGTCGTTTGTACTGGTGACGAAACTCAGTGTTACGGTACATGGGTTCCTATT
GGGCTTGCTATCCCTGAAAATGAGGGTGGTGGCTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTTCTGAGGGTGGCGGTAC
TAAACCTCCTGAGTACGGTGATACACCTATTCCGGGCTATACTTATATCAACCCTCTCGACAGCACTTATCCGCCTGGTA
CTGGAGCAAAACCCCGCTAATCCTAAATCCTTCTCTTGGAGGAGTCTCAGCCTCTTAATACTTTCATGTTTCAGAATAAT
AGGTCCGAATAAGGCAGGGTGCATAAGCTGTTTATACGGGACTGTTACTCAAGGCACTGACCCGATTAAAGTTAGTAACA
GTACACTCCCGTGAATCATACGAAGCATGGTAGGACGCTTAACTGGGACAGGAAAAGTC。


2.一种通过哺乳动物细胞表达PD-L1抗原免疫羊驼制备PD-L1纳米抗体的方法，其特征在于，所述的通过哺乳动物细胞表达PD-L1抗原免疫羊驼制备PD-L1纳米抗体的方法包括：
通过PD-L1抗原为哺乳动物细胞瞬时转染表达，使用生物素化方法筛选得到纳米抗体片段SEQIDNO：1。


3.如权利要求1所述的通过哺乳动物细胞表达PD-L1抗原免疫羊驼制备PD-L1纳米抗体的方法，其特征在于，所述通过哺乳动物细胞表达PD-L1抗原免疫羊驼制备PD-L1纳米抗体的方法进一步包括：
步骤一：构建载体：目的片段扩增，换载酶切，目的片段与载体连接，转化，筛选克隆；
步骤二：进行蛋白鉴定、表达；
步骤三：构建抗体库：进行样品总RNA提取及cDNA合成，VHH文库片段的制备，电转化和文库构建；
步骤四：进行生物素化筛选和原核表达。


4.如权利要求3所述的通过哺乳动物细胞表达PD-L1抗原免疫羊驼制备PD-L1纳米抗体的方法，其特征在于，所述步骤一中，目的片段扩增中，包括：
(1)设计合成引物：
PD-L1上游引物5′-GACACGAATTCGCCACC-3′；
PD-L1下游引物5′-GTGTCAAGCTTTCACTTATCATCA-...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈创夫，吴鹏，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65