【技术实现步骤摘要】
一种组织工程后板层角膜的体外构建方法
本专利技术属于再生医学组织工程领域的构建技术，具体涉及一种组织工程后板层角膜的体外构建方法。
技术介绍
角膜位于眼球最前端，是人体唯一的免疫赦免区，无血管而呈现透明状，为眼睛提供大部分屈光力。角膜的组织结构由外到内依次为角膜上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层。其中角膜内皮层由单层、扁平、连接紧密的六角形内皮样细胞镶嵌而成，对维持角膜的透明度及正常厚度起着关键作用，并具有角膜-房水屏障功能。角膜中没有血管，只能经内皮层从房水中获取养分/氧气或透过泪液为上皮部分供养/氧。人角膜内皮细胞在成年后丧失了分裂能力，且以每年0.3%~0.6%的比例死亡。局部细胞损伤后只能依靠邻近细胞的增大、扩展和移行来填补缺损区，以维持角膜内皮层的单层形态和功能。因此，在体外持续扩增培养人角膜内皮细胞是非常困难的，目前还属于国际难题。此外，白内障等手术损伤、长期高眼压（青光眼）、成形玻璃体持续接触角膜内皮、持续重度虹膜炎和严重虹膜前粘连等均可引起大量角膜内皮细胞的损伤与快速死亡，一旦角膜内皮细胞密度低于维持...
【技术保护点】
1.一种组织工程后板层角膜的体外构建方法，包括作为角膜种子细胞的人角膜基质细胞和人角膜内皮细胞，以及带有后弹力层的脱细胞猪角膜基质作为组织工程角膜载体支架，其特征是首先在上述载体支架中接种角膜基质种子细胞构建出组织工程后板层角膜的基质层部分，再在上述构建的基质层部分的后弹力层上接种角膜内皮种子细胞，即构建出组织结构和功能与正常后板层角膜相近的组织工程后板层角膜。/n
【技术特征摘要】
1.一种组织工程后板层角膜的体外构建方法，包括作为角膜种子细胞的人角膜基质细胞和人角膜内皮细胞，以及带有后弹力层的脱细胞猪角膜基质作为组织工程角膜载体支架，其特征是首先在上述载体支架中接种角膜基质种子细胞构建出组织工程后板层角膜的基质层部分，再在上述构建的基质层部分的后弹力层上接种角膜内皮种子细胞，即构建出组织结构和功能与正常后板层角膜相近的组织工程后板层角膜。
2.如权利要求1所述的组织工程后板层角膜的体外构建方法，其特征是上述角膜基质种子细胞和角膜内皮种子细胞可以由角膜缘干细胞诱导分化而来的角膜基质样细胞和角膜内皮样细胞替代。
3.如权利要求1所述的组织工程后板层角膜的体外构建方法，其特征在于上述基质层部分的构建是首先用载体支架复水溶液对组织工程角膜载体支架进行复水，然后用构建专用培养液A将人角膜基质细胞制成角膜基质细胞悬液，再将该细胞悬液注射入经载体支架复水溶液复水后的载体支架中，再加入构建专用培养液A后进行体外培养，然后更换构建专用培养液B继续培养，得到组织工程后板层角膜的基质层部分；再用构建专用培养液C将人角膜内皮细胞制成角膜内皮细胞悬液后，将该细胞悬液接种于上述组织工程后板层角膜的基质层部分的后弹力层上进行体外培养，再将构建专用培养液C更换为构建专用培养液D进行培养，然后更换新的上述构建专用培养液D继续培养，即得组织结构和功能与正常后板层角膜相近的组织工程后板层角膜；
上述构建专用培养液A的配方是含有15%胎牛血清、0.2-0.4mg/mL纤连蛋白和0.01-0.02mg/mL碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养液；
上述构建专用培养液B的配方是含有15%小牛血清、0.3-0.5mg/mL凝血酸、0.1-0.5mg/mLε-氨基己酸、1-5mg/mL抗坏血酸和1-5μg/mL基质金属蛋白酶抑制剂BB-94的DMEM/F12培养液；
上述构建专用培养液C的配方是含有10%胎牛血清、0.2-0.4mg/mL纤连蛋白、0.01-0.02mg/mL碱性成纤维细胞生长因子和0.01-0.02mg/mL表皮细胞生长因子的DMEM/F12培养液；
上述构建专用培养液D的配方是20%小牛血清、0.2-0.4mg/mL氨基葡萄糖盐酸盐、0.1-0.5mg/mLε-氨基己酸、30-50ng/mL人骨形态发生蛋白7、1-5mg/mL抗坏血酸和1...
【专利技术属性】
技术研发人员：樊廷俊，徐彬，赵君，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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