Slc12a9基因敲除小鼠模型及其建立方法和用途技术

本发明专利技术提供了一种Slc12a9基因敲除模型小鼠，及其培育方法和该小鼠模型在研究高血压的发病机制中的用途。所述模型小鼠是敲除了SLC12A9基因中的第5号外显子、第6号外显子和第7号外显子。本发明专利技术所述培育方法简单，且模型制作简单，重复性好；制作成本低。在临床表现与人类高血压相似，所述可用于人类高血压的研究，对阐明高血压的发病机制有重要的实际意义。研究还显示该模型为肿瘤的研究提供一种新的模型，可以作为预测脑胶质瘤患者预后的指标。因此，具有良好的推广应用价值。

Slc12a9 knockout mouse model and its establishment and Application

【技术实现步骤摘要】
Slc12a9基因敲除小鼠模型及其建立方法和用途
本专利技术涉及小鼠模型，尤其是Slc12a9基因敲除鼠的培育方法及该小鼠模型的用途。
技术介绍
高血压会影响我们的动脉、心脏等重要器官和结构。长期发展下去，还会造成心梗、中风等危及生命的症状。我国高血压患病率以达到23％，目前，导致高血压的机制尚不明确。Slc12a9广泛分布体内细胞的细胞膜上，介导细胞内外的钠离子，钾离子，氯离子的转运，与细胞内外的渗透压等密切相关。SLC家族蛋白在肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。现有技术中，Slc12a9基因位于5号染色体，基因组长19040kb，有14个外显子，其转录本为19.040kb，编码914个氨基酸。目前国际上未见Slc12a9与高血压的报道，建立Slc12a9基因敲除小鼠模型，对阐明高血压的发病机制有重要的实际意义。
技术实现思路
基于现有技术的状况，本专利技术提供了一种模型小鼠，为Slc12a9基因敲除小鼠。进一步的，敲除了SLC12A9基因的中的第5号外显子、第6号外显子和第7号外显子。本专利技术还提供了一种建立Slc12a9基因敲除小鼠模型的方法，包括以下步骤：针对小鼠SLC12A9基因，设计基因敲除策略，敲除区域选择：第5号外显子、第6号外显子和第7号外显子；采用CRISPR-Cas9基因编辑方法，获得F0代小鼠；将阳性F0代小鼠和C57BL/6J配繁后，得到具有Slc12a9基因敲除的阳性F1代小鼠SLC12A9Slc12a9。进一步的，所述CRISPR-Cas9基因编辑方法包括分别设计和构建5S1sgRNA和3S1sgRNA，并进行体外活性测试，制备Cas9混样体系；并将sgRNA与Cas9蛋白结合，引导Cas9酶靶向基因组DNA进行剪切。本专利技术还建立Slc12a9基因敲除小鼠模型的方法，包括以下步骤：(1)针对小鼠SLC12A9基因，设计基因敲除策略，敲除区域选择：第5号外显子、第6号外显子和第7号外显子；(2)分别设计和构建5S1sgRNA和3S1sgRNA，并进行体外活性测试，制备Cas9混样体系；(3)将cas9混样体系混合注射到受精卵中，移植，获得F0代小鼠；(4)将阳性F0代小鼠和C57BL/6J配繁后，得到具有Slc12a9基因敲除的阳性F1代小鼠SLC12A9Slc12a9。进一步的，所述5S1sgRNA和3S1sgRNA分别为5S1：CTCGCAGACCAAACAACTCC；3S1：CTACTATTATAGAGAGTTTG。进一步的，所述cas9混样体系包括5S1和3S1两条sgRNA和cas9。进一步的，cas9混样体系中包括Cas9蛋白20ng/μl,两条sgRNA浓度是各10ng/μl。进一步的，阳性F1带小鼠用于保种建系，不同的保种建系之间原则上不允许交配。本专利技术还提供了Slc12a9基因敲除小鼠在作为高血压的发病研究的模型鼠的用途。本专利技术所述模型小鼠在高血压的发病研究中的应用。以及本专利技术所述方法在制备高血压发病研究的模型鼠中的应用。本专利技术所述的Slc12a9基因敲除小鼠模型及其建立方法填补了高血压发病机制研究领域的一项空白，不仅模型制作简单，重复性好，制作成本低廉，同时该Slc12a9基因敲除小鼠模型的临床表现与人类高血压相似，因此可用于人类高血压的研究，同时还可进行有关的药物干预实验。并在肿瘤研究中也具有一定的价值。因此可以在国内外推广应用。附图说明图1是构建策略示意图。图2是简单版构建策略示意图。具体实施方式下面结合附图与实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1建立SLC12A9敲除小鼠模型一、Cas9混样体系1.sgRNA设计。如图1和2所示构建策略图所示，确定敲除SLC12A9基因的一段基因组序列，所述敲除的基因组序列包含第5号外显子(Exon5)、第6号外显子(Exon6)和第7号外显子(Exon7)，其编码区序列如下：Exon5:ATGCCACAGGCTCCAGTGGGATCCAGGTTCTACCCCAGGGTTATGGCTGGAATCTGCTCTATGGCTCCCTTCTGCTGGGCCTCGTGGGTGGTGTGTGCACTTTGGGAGCTGGGCTCTATGCCCGAGCCTCCTTTCTTACATTCCTGCTGGTTTCTGGCTCCCTGGCCTCCGTGCTGGTCAGTTTTGTGGCAGTGGGACCCAGGAACATCCCGTTAGCTCCTCGACCGGGCACCAATGCTTCCTCCGTGCCACACCGGCATGGCCACTTCACTGGGTTCAACGGAAGCACCCTAAGGGACAACTTAGGTGExon6:CTGGCTACGCCGAGGACTACACCACAGGGGCCATGATGACTTTCGCCAGTGTTTTTGCTGTCCTCTTCAACGGCTGCACGGGCATCATGGCTGGGGCCAACATGTCAGExon7:GGGAGCTGAAGGACCCCAGCCGGGCAATTCCTCTGGGCACCATCATTGCAGTCGCCTATACCTTCTTCATCTACATCCTGCTGTTCTTCCTCTCCAGCTTCACTTGTGACAG设计sgRNA序列，所述sgRNA序列如表1所述。表1sgRNA序列sgRNA名称sgRNA序列(5’→3’)PAM5S1CTCGCAGACCAAACAACTCCGGG3S1CTACTATTATAGAGAGTTTGTGG2.sgRNA体外活性测试分别设计合成表1所述5S1和3S1两个sgRNA，以及Cas9体外酶切靶点DNA序列，Cas9酶识别Pam序列并进行切割，获得两条DNA片段(5S1和3S1两个sgRNA)。通过琼脂糖电泳分析，观察sgRNA介导的DNA被切割的百分比，从而判断sgRNA的活性和切割效率。在本次实验中的切割效率分别是5S1为70％，3S1为:90％，因此sgRNA活性是高效的。3.制备Cas9混样体系其中所述Cas9混样体系为混合物，其包括2条sgRNA(即5S1和3S1两个sgRNA)和Cas9，浓度分别为Cas9蛋白20ng/μl,两条sgRNA浓度是各10ng/μl。二、显微注射及移植制备F0代小鼠的方法包括如下步骤：小鼠的超排；注射受精卵、移植；得到F0代小鼠。小鼠品系：C57BL/6J具体方法：1、挑选实验小鼠挑选5-6周龄、体重18-22g的小鼠。2、小鼠超排和注射受精卵小鼠超排和注射指的是用4周龄的雌鼠，先注射PSMG，48h后注射HCG，24h后取卵，然后体外受精，拿到本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种模型小鼠，其特征在于，为Slc12a9基因敲除小鼠。/n

【技术特征摘要】
1.一种模型小鼠，其特征在于，为Slc12a9基因敲除小鼠。


2.根据权利要求1所述的模型小鼠，其特征在于，敲除了SLC12A9基因的中的第5号外显子、第6号外显子和第7号外显子。


3.建立Slc12a9基因敲除小鼠模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)针对小鼠SLC12A9基因，设计基因敲除策略，敲除区域选择：第5号外显子、第6号外显子和第7号外显子；
(2)采用CRISPR-Cas9基因编辑方法，获得F0代小鼠；
(3)将阳性F0代小鼠和C57BL/6J配繁后，得到具有Slc12a9基因敲除的阳性F1代小鼠SLC12A9Slc12a9。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述CRISPR-Cas9基因编辑方法包括分别设计和构建5S1sgRNA和3S1sgRNA，并进行体外活性测试，制备Cas9混样体系；并将sgRNA与Cas9蛋白结合，引导Cas9酶靶向基因组DNA进行剪切。


5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)针对小鼠SLC12A9基因，设计基因敲除...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙维建，林以诺，吴昊，沈贤，王文茜，郑志强，游涛，
申请(专利权)人：温州医科大学附属第二医院，温州医科大学附属育英儿童医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33