一种灭活型病毒样本RNA保存液及其制备方法技术

本发明专利技术公开一种灭活型病毒样本RNA保存液及其制备方法，其中保存液包括以下组分：柠檬酸钠、蛋白酶K、浓硫酸、乙二胺四乙酸和硫酸铵，其中柠檬酸钠的终浓度为10mM~35mM，蛋白酶K的终浓度为50~800μg/ml，浓硫酸的终浓度为0.5%~5%（V/V），乙二胺四乙酸的终浓度为5mM~50mM，硫酸铵的终浓度为45%~80%（W/V）。本发明专利技术保存液安全无毒、配制简单、使用方便；病毒进入保存液即可使病毒灭活，无须冷藏运输及灭活处理；能在室温下避免RNA降解，可多次冻融而不影响RNA提取的质量；提取过程中也能防止RNA降解，提取的RNA完整性更好，特别适用于有强感染性的流行病毒样本的采集。

A kind of RNA preservation solution for inactivated virus samples and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
一种灭活型病毒样本RNA保存液及其制备方法
本专利技术涉及生物医学
，尤其涉及一种灭活型病毒样本RNA保存液及其制备方法。
技术介绍
2019新型冠状病毒（SARS-CoV-2）是2019年在人体中发现的冠状病毒新毒株，该病毒潜伏期具有传染性，所致疾病没有特异治疗方法，对于数量庞大的疑似患者和密切接触者，早发现、早报告、早隔离、早治疗仍是基本的防控措施。新型冠状病毒目前最常用的检测方法是核酸检测，但火速上市的核酸检测试剂盒出现了阴性率高的问题，这个问题可能让漏诊病例助推疫情蔓延。病毒的核酸检测需要经过采样、运输、提取核酸，RT-qPCR检测这些步骤才能最终获得检测结果，每一个步骤都可能出问题而导致结果不准确，如何控制这些环节的出错率，提升检测的准确性和灵敏度，是亟待解决的问题。根据《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南（第四版）》，在普遍用于新冠病毒样本采集的病毒保存液是可保存病毒活性的等渗盐溶液或磷酸盐缓冲液，里面的成分主要是氯化钠，能保存病毒的活性，但无法抑制RNA的降解。这种病毒保存液存在两个问题，第一个问题是，有活性的病毒使运输和检测人员处于被感染的风险中，特别是采集高传染性、高致病性的病毒（如新型冠状病毒）；第二个问题是，该保存液无法避免RNA的降解，采样后需低温运输，并且不能反复冻融，否则，RNA极易受到RNA酶的降解，这些苛刻的条件使检测更困难，RNA的降解是检测阴性率高的其中一个原因。因此，开发可灭活病毒并保护RNA免受RNA酶降解的病毒RNA保存液是优化病毒样本采集这一步骤的关键，也是为后续荧光定量或测序检测提供有质量保证核酸的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种灭活型病毒样本RNA保存液及其制备方法，其中保存液安全无毒，使用简单，可常温保存病毒样本，保质期达到1年；病毒样本无须冷藏运输及灭活处理，病毒样本进入保存液即可使病毒灭活，并在室温下有效避免RNA降解，冻存的病毒样本可多次冻融而不影响RNA提取的质量；病毒样本保存液可与大多数RNA分离纯化实验操作兼容，特别适用于有强感染性的流行病毒样本的采集。本专利技术的技术方案如下：提供一种灭活型病毒样本RNA保存液，包括以下组分：柠檬酸钠、蛋白酶K、浓硫酸、乙二胺四乙酸和硫酸铵，其中柠檬酸钠的终浓度为10mM~35mM，蛋白酶K的终浓度为50~800μg/ml，浓硫酸的终浓度为0.5%~5%（V/V），乙二胺四乙酸的终浓度为5mM~50mM，硫酸铵的终浓度为45%~80%（W/V）。进一步地，所述柠檬酸钠的终浓度为15mM~30mM，所述蛋白酶K的终浓度为100~600μg/ml，所述浓硫酸的终浓度为1%~3%（V/V），所述乙二胺四乙酸的终浓度为7mM~30mM，所述硫酸铵的终浓度为50%~70%（W/V）。进一步地，所述保存液还包括溶剂，所述溶剂为灭菌水。进一步地，所述保存液的pH值为4.2~6.5。进一步地，所述保存液的pH值为4.5~5.8。进一步地，所述保存液的适用样本包括上呼吸道标本、下呼吸道标本、眼结膜拭子、肛拭子、人组织的离体样本、动植物组织的离体样本、人工培养的细胞、血液、体液。进一步地，所述上呼吸道样本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物；所述下呼吸道标本包括深咳痰液、呼吸道抽取物、肺泡组织活检标本。进一步地，所述适用样本为病毒样本。本专利技术还提供一种制备如上所述的灭活型病毒样本RNA保存液的方法，包括以下步骤：配置乙二胺四乙酸水溶液，调PH至7.0~8.5；配置柠檬酸钠水溶液；配置蛋白酶K溶液；配制硫酸铵溶液，在溶剂中加入硫酸铵搅拌使其溶解；将上述各配置溶液按比例混合并搅拌均匀后用浓硫酸调pH至4.5~5.8，再用溶剂定容，使各组分达到权利要求1所述浓度；用滤膜过滤除菌，分装保存，得到所述灭活型病毒样本RNA保存液。进一步地，所述溶剂为灭菌水；所述滤膜的孔径为0.15μm~0.35μm。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术保存液安全无毒，使用简单，可广泛用于医院、家庭、科研院所等常温条件下生物样本的大规模采集与保存；采集的病毒样本置于保护液中，无须冷藏运输及灭活处理，病毒进入保存液即可使病毒灭活，使运输和检测人员免于感染的风险；并能在室温下有效避免RNA降解，一定条件下冻存的病毒样本可多次冻融而不影响RNA提取的质量；提取过程中也能防止RNA降解，提取的RNA完整性更好，特别适用于有强感染性的流行病毒样本的采集。附图说明图1为慢病毒在灭活型病毒样本RNA保存液中分别保存1d、4d或8d，RT-qPCR检测GFP基因的结果图；图2为慢病毒在PBS或病毒RNA保存液中保存过夜，稀释后感染293T细胞，荧光显微镜下观察病毒感染活性的结果图；图3为细胞样本室温放置3天后的RNA凝胶电泳图；图4为小鼠肝脏样本室温放置4天后的RNA凝胶电泳图；图5为小鼠肝脏样本室温放置7天后的RNA凝胶电泳图。具体实施方式为了对本专利技术的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现详细说明本专利技术的具体实施方式。显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。一、本专利技术灭活型病毒样本RNA保存液的配方主要包括以下组分：柠檬酸钠、蛋白酶K、浓硫酸、乙二胺四乙酸和硫酸铵，其中柠檬酸钠的终浓度为10mM~35mM，优选为10mM~30mM；蛋白酶K的终浓度为50~800μg/ml，优选为100~600μg/ml；浓硫酸的终浓度为0.5%~5%（V/V），优选为1%~3%（V/V）；乙二胺四乙酸的终浓度为5mM~50mM，优选为7mM~30mM；硫酸铵的终浓度为45%~80%（W/V），优选为50%~70%（W/V）。上述保存液还包括溶剂，优选为灭菌水。上述保存液的pH值为4.2~6.5，优选pH值为4.5~5.8。上述保存液的适用样本包括上呼吸道标本（咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物）、下呼吸道标本（深咳痰液、呼吸道抽取物、肺泡组织活检标本）、眼结膜拭子、肛拭子、人组织的离体样本、动植物组织的离体样本、人工培养的细胞、血液、体液。适用样本优选为病毒样本。二、配置所述灭活型病毒样本RNA保存液，具体方法为：配置乙二胺四乙酸（EDTA）水溶液，调PH至7.0~8.5；配置柠檬酸钠水溶液；配置蛋白酶K水溶液；在灭菌水中加入硫酸铵搅拌使其溶解；将上述各配置溶液按比例混合搅拌均匀后用浓硫酸调pH至4.5~5.8，用灭菌水定容，使各组分达到上述要求的终浓度；用滤膜过滤除菌，分装保存，得到所述灭活型病毒样本RNA保存液。下面提供本专利技术的六种具体实施方式，所述灭活型病毒样本RNA保存液的配方如表1所示。表1组份...

【技术保护点】
1.一种灭活型病毒样本RNA保存液，其特征在于，包括以下组分：柠檬酸钠、蛋白酶K、浓硫酸、乙二胺四乙酸和硫酸铵，其中柠檬酸钠的终浓度为10mM~35mM，蛋白酶K的终浓度为50~800μg/ml，浓硫酸的终浓度为0.5%~5%（V/V），乙二胺四乙酸的终浓度为5mM~50mM，硫酸铵的终浓度为45%~80%（W/V）。/n

【技术特征摘要】
1.一种灭活型病毒样本RNA保存液，其特征在于，包括以下组分：柠檬酸钠、蛋白酶K、浓硫酸、乙二胺四乙酸和硫酸铵，其中柠檬酸钠的终浓度为10mM~35mM，蛋白酶K的终浓度为50~800μg/ml，浓硫酸的终浓度为0.5%~5%（V/V），乙二胺四乙酸的终浓度为5mM~50mM，硫酸铵的终浓度为45%~80%（W/V）。


2.根据权利要求1所述的灭活型病毒样本RNA保存液，其特征在于，所述柠檬酸钠的终浓度为15mM~30mM，所述蛋白酶K的终浓度为100~600μg/ml，所述浓硫酸的终浓度为1%~3%（V/V），所述乙二胺四乙酸的终浓度为7mM~30mM，所述硫酸铵的终浓度为50%~70%（W/V）。


3.根据利要求1或2所述的灭活型病毒样本RNA保存液，其特征在于，还包括溶剂，所述溶剂为灭菌水。


4.根据权利要求1或2所述的灭活型病毒样本RNA保存液，其特征在于，所述保存液的pH值为4.2~6.5。


5.根据权利要求4所述的灭活型病毒样本RNA保存液，其特征在于，所述保存液的pH值为4.5~5.8。


6.根据权利要求1或2所述的灭活型病毒样本RN...

【专利技术属性】
技术研发人员：张小英，
申请(专利权)人：深圳市上为生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44