一种脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因及其应用，所述基因的序列如SEQ ID NO.1所示。所述基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白包含三个结构域，分别为EcVBP‑PC1、EcVBP‑PC2、EcVBP‑PC3。上述基因

Vitellin binding protein gene and its application in white shrimp

【技术实现步骤摘要】
一种脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因及其应用
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因及其应用。
技术介绍
在我国，虾蟹类等十足目甲壳动物是重要的水产养殖经济物种，随着市场对优质水产品需求量的不断增长，虾蟹类养殖在水产养殖中占据越来越重要的地位。良种的生产和培育作为水产养殖的关键一步，是从根本上提升虾蟹等水产品品质的重要手段。随着分子生物学和细胞生物学等学科的发展，新的育种方法如转基因育种等优势逐渐显现。基因敲除与基因敲入技术是研究基因的重要手段，2013年初兴起的CRISPR/Cas系统便是实现基因敲除与敲入的有效工具。但目前在模式动物中开展CRISPR/Cas9技术主要是通过显微注射受精卵的方式进行的，该方式较为困难且效率低下，极易损坏受精卵并对操作人员技能要求较高，因而限制了CRISPR/Cas9技术更广泛的应用。在昆虫和其它节肢动物中，卵黄蛋白是胚胎及幼体早期发育的重要营养成分。其前体在脂肪体中合成，然后分泌到血淋巴中。在卵黄发生过程中，在卵母细胞膜上的受体参与结合卵黄蛋白前体配体，使这些配体内化，积聚在内囊泡中，变成了胚胎发育所需要的卵黄营养颗粒。从1980年开始，研究人员便开始针对这种受体介导性胞吞作用，将这种特异性配体开发成传递药物到哺乳动物细胞的载体。2018年8月，宾夕法尼亚州大学Rasgon的研究团队开发了一种受体介导的卵巢转导技术(也称ReMOTControl)。在卵巢和卵子成熟期间，合成的卵黄蛋白分泌到体液中并被带入卵巢；并且以埃及伊蚊为动物模型，验证了该方法的可行性(CHAVERRA-RODRIGUEZD,MACIASVM,HUGHESGL,etal.TargeteddeliveryofCRISPR-Cas9ribonucleoproteinintoarthropodovariesforheritablegermlinegeneediting[J].NatureCommunications,2018,9)。与胚胎显微注射相比，通过ReMOTControl导入方式开展的基因编辑效率高，技术上更容易实现，成本大大降低，甚至非专业实验人员也可以操作。在十足目甲壳动物中，尚未见通过类似上述机理实现外源蛋白导入受精卵的报道。因此，对脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白及其编码基因的研究不仅具有重要的理论意义，在实践上也具有巨大的应用潜力，其必将为今后开展重要经济甲壳动物的基因编辑与分子设计育种开辟广阔前景。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因及其应用，以为外源蛋白进入甲壳动物受精卵提供了一种新途径。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因EcVBP，所述基因的序列如SEQIDNO.1所示。一种脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因EcVBP，所述基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。所述脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白包含三个结构域，分别为EcVBP-PC1、EcVBP-PC2、EcVBP-PC3，EcVBP-PC1对应的基因序列如SEQIDNO.3所示，EcVBP-PC2对应的基因序列如SEQIDNO.4所示，EcVBP-PC3对应的基因序列如SEQIDNO.5所示。上述的脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因EcVBP在卵黄蛋白结合蛋白介导外源蛋白进入甲壳动物受精卵中的应用。所述应用是将EcVBP-PC1、EcVBP-PC2或EcVBP-PC3对应的基因与外源蛋白基因构建为重组质粒，并经大肠杆菌工程菌高效表达重组蛋白，将重组蛋白纯化后注射进性腺成熟的甲壳动物体液中。所述的重组质粒的表达载体选用pCT7-CHISP6H，工程菌选用大肠杆菌BL21(DE3)工程菌。上述应用具体包括以下步骤：a、以脊尾白虾cDNA为模板，通过PCR扩增的方式获得EcVBP-PC1、EcVBP-PC2或EcVBP-PC3对应的基因片段；b、将EcVBP-PC1、EcVBP-PC2或EcVBP-PC3对应的PCR产物与表达载体pCT7-CHISP6H、外源蛋白EGFP基因共同构建pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC1-EGFP、pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC2-EGFP或pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC3-EGFP重组载体；c、将pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC1-EGFP、pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC2-EGFP或pCT7-CHISP6H-EcVBP-PC3-EGFP重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达，获得表达产物；d、利用金属螯合柱层析的方法分离纯化重组蛋白，将重组蛋白注射进性腺成熟的雌性中华锯齿米虾体液中，待其交配产卵后，可在其受精卵中检测到外源蛋白EGFP的绿色荧光信号。步骤a中，EcVBP-PC1扩增的上游引物序列如SEQIDNO.6所示，EcVBP-PC1扩增的下游引物序列如SEQIDNO.7所示；EcVBP-PC2扩增的上游引物序列如SEQIDNO.8所示，EcVBP-PC2扩增的下游引物序列如SEQIDNO.9所示；EcVBP-PC3扩增的上游引物序列如SEQIDNO.10所示，EcVBP-PC3扩增的下游引物序列如SEQIDNO.11所示。本专利技术相对现有技术的有益效果在于：1、本专利技术确定了一种脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因(EcVBP)的编码序列，也明晰了其所编码的氨基酸序列，通过结构域预测发现VBP存在3个典型的结构域(EcVBP-PC1，EcVBP-PC2，EcVBP-PC3)。2、本专利技术成功构建了脊尾白虾EcVBP-PC1，EcVBP-PC2，EcVBP-PC3与EGFP的融合蛋白质粒，通过优化诱导条件，在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达重组蛋白。3、本专利技术将重组蛋白注射进性腺成熟的雌性中华锯齿米虾体液中，待其交配产卵后，可在其受精卵中检测到绿色荧光信号，从而证实了VBP作为“分子货车”携带外源蛋白进入受精卵的可行性，为今后开展甲壳动物的基因编辑与分子设计育种提供了基础。附图说明图1为EcVBPC1-EGFP(左)、EcVBPC2-EGFP(中)、EcVBPC3-EGFP(右)融合蛋白发射荧光的照片。图2为注射EcVBPC2-EGFP的中华米虾受精卵照片(a-d依次为在自然光、绿色荧光、蓝色荧光、紫外光下观察的照片)。图3为正常中华米虾受精卵照片(a-d依次为在自然光、绿色荧光、蓝色荧光、紫外光下观察的照片)。具体实施方式下面结合具体的实施例对本专利技术的技术效果进行详细阐述。本专利技术中未提及的实验方法和实验条件均为本领域技术人员公知的常规实验操作。实施例1重组表达载体的构建a、基因克隆：从脊尾白虾(购于青岛沙子口市场)头胸甲cDNA文库中筛选到一种卵黄蛋白结合蛋白基因EcVBP(序列如SEQIDNO.1所示)，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因

【技术特征摘要】
1.一种脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因EcVBP，其特征是，所述基因的序列如SEQIDNO.1所示。


2.一种脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因EcVBP，其特征是，所述基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.根据权利要求1或2所述的脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因EcVBP，其特征是，所述脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白包含三个结构域，分别为EcVBP-PC1、EcVBP-PC2、EcVBP-PC3，EcVBP-PC1对应的基因序列如SEQIDNO.3所示，EcVBP-PC2对应的基因序列如SEQIDNO.4所示，EcVBP-PC3对应的基因序列如SEQIDNO.5所示。


4.一种权利要求3所述的脊尾白虾卵黄蛋白结合蛋白基因EcVBP在卵黄蛋白结合蛋白介导外源蛋白进入甲壳动物受精卵中的应用。


5.根据权利要求4所述的应用，其特征是，将EcVBP-PC1、EcVBP-PC2或EcVBP-PC3对应的基因与外源蛋白基因构建为重组质粒，并经大肠杆菌工程菌高效表达重组蛋白，将重组蛋白纯化后注射进性腺成熟的甲壳动物体液中。


6.根据权利要求5所述的应用，其特征是，重组质粒的表达载体选用pCT7-CHISP6H，工程菌选用大肠杆菌BL21(DE3)工程菌。


7.根据权利要求5所述的应用，其特征是，包括以下步骤：
a、以脊尾白虾cDNA为模板，通过PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：张继泉，邢珂凡，刘玉洁，孙玉英，
申请(专利权)人：河北大学，
类型：发明
国别省市：河北;13