本发明专利技术公开了胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒及检测方法，包括CTCs分离试剂和CTCs鉴定试剂；CTCs分离试剂包括偶联EpCAM和CSV单克隆抗体包被的免疫磁珠，CTCs鉴定试剂包括封闭液、缓冲液、固定液、透化液、染色液和封片剂。将CTCs分离试剂与含有CTCs的血液样本混合，得到分离的CTCs；将分离的CTCs与CTCs鉴定试剂混合，观察细胞染色情况，计算血液样本中的CTCs数目。本发明专利技术可同时对上皮性和间皮性CTCs进行分离，联合多种胃肠恶性肿瘤特异性抗体对富集后的细胞进行鉴定，比单一使用CK抗体的敏感度更高。大部分患者能捕捉到数十至数百个CTCs，与现有临床检测方法相比，CTCs捕捉效率大幅提升，为CTCs下游分子分析奠定了物质基础。
Detection kit and method of circulating tumor cells in gastrointestinal cancer
【技术实现步骤摘要】
胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及细胞染色检测领域，尤其涉及的是一种胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
现有技术中，胃肠道恶性肿瘤是我国临床最常见消化系统恶性肿瘤，其发病率和死亡率远高于世界平均水平，且呈发病率和年轻化双线升高趋势。影响胃肠道恶性肿瘤预后的重要指标之一是肿瘤分期，早期胃肠道恶性肿瘤经治疗后，患者的5年存活率可达90～95％以上，但由于胃肠道恶性肿瘤发病早期70％以上患者无明显症状，在我国胃肠道恶性肿瘤早期检出率仅不足10％，绝大多数患者确诊时已为中晚期，此时肿瘤极易发生血管与淋巴管转移，疗效与预后较差，5年生存率长期徘徊在10％左右。目前，胃肠道恶性肿瘤常规临床检测手段有超声、X射线、血清肿瘤标志物、内镜、CT、组织活检等，但传统的检测方法和技术很难发现早期和微小转移病灶，例如影像学无法发现早期微转移；骨扫描发现转移病灶时，疾病已进展至晚期；肿瘤评分和临床分期的综合判断只能判断预后，无法实时提示肿瘤转移情况。CA125、CA199、CA724、CEA等血清肿瘤标志物已经普遍应用于疗效和复发监控，然其肿瘤标志物的敏感性、特异性、有效性较低，因而无法为医师提供准确的检测依据。因此，迫切需要寻找一种实时监测的新型标志物。循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells，CTCs)主要是指进入到外周血液中的肿瘤细胞，CTCs在血液中的含量极为稀有，仅占外周血白细胞的1/106～1/107，可随血液循环迁徙至相关组织或器官，在合适的条件下发展成肿瘤病灶，与癌症患者的临床分期、无进展生存期、总生存期、药物疗效以及早期复发和转移均密切相关。CTCs检测即利用特殊方法对外周血中的CTCs进行分离和富集，并通过细胞计数或基因水平分析等手段对获得的CTCs进行检测。大量研究表明，CTCs具有实时监测功能，对恶性肿瘤的早期诊断、预后判断、疗效评估、个体化用药指导及肿瘤转移复发监测等方面均具有重要的临床应用价值，是一种非侵入性的新型诊断标志，被称为“液体活检”。与胃肠癌常规临床检测手段相比，CTCs检测肿瘤具有灵敏度高、特异性高、准确率高、取样便捷且可多次、重复性检测等优势。CTCs的富集方法可以分为生物化学特性富集法(亲和性富集法)和物理特性富集法。亲和性富集法主要是根据通过细胞表面特异性表达的蛋白质生物标志物分离靶细胞，包括正向捕获CTCs的阳性富集法和负向去除白细胞的阴性富集法。物理特性富集法主要是根据CTCs的大小、密度、力学和介电性能等物理特性将CTCs筛选出来。与普通血细胞相比，CTCs具有某些特殊的生物标志物，包括CTCs表面的上皮细胞粘附分子(Epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM)、细胞角蛋白(Cytokeratin，CK)以及肿瘤特异性抗原，而血液中几乎所有的细胞都是反磁性或弱磁性的，利用肿瘤细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单克隆抗体相结合，继而在外加磁场中通过相应抗原抗体复合物与磁珠吸附而滞留在磁场中或定向移动到指定区域，没有表面抗原的其它细胞由于不能与连接磁珠的特异性单克隆抗体结合而不能在磁场中停留，从而使肿瘤细胞得以从血液中分离出来。截至目前为止，免疫磁珠CTCs分离技术是全球唯一一个被美国食药监局(FDA)和中国国家药品监督管理局(NMPA)批准应用与临床诊断的技术。然而，该方法的敏感性一定程度上受到CTCs表面抗原表达的制约。独采用EpCAM抗体捕获CTCs，由于EpCAM在CTCs的表达率一般为60-70％，往往会丢失部分CTCs；单一的CK抗体也不能完全识别癌细胞表达的所有CKs；在CTCs上皮间质化过程中，一些基于标准化上皮标志物的筛选抗体无法检测出所有CTCs等等。这一切都受到目标抗原的表达量与特异性以及与相应抗体的结合能力影响。以上各种因素导致CellSearch对CTCs富集效率较低，绝大部分临床样本仅能检测出数个CTCs，这一方面导致检测的敏感性较低，另一方面，在细胞量如此少的情况下，很难进行下一步深入分子分析。因此，研发富集效率更高的CTCs检测技术、进一步提高CTCs检测敏感度对CTCs检测技术的进一步应用于临床至关重要。因此，现有技术存在缺陷，需要改进。附图说明图1为本专利技术的CTCs检测胃肠道恶性肿瘤的ROC曲线图。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒及检测方法，通过分离和鉴定两个步骤，将多种胃肠道恶性肿瘤细胞特异性抗体组合使用，提高循环肿瘤细胞检测的敏感度。本专利技术的技术方案如下：一种胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒，包括CTCs分离试剂和CTCs鉴定试剂；所述CTCs分离试剂包括偶联EpCAM和CSV单克隆抗体包被的免疫磁珠，所述CTCs鉴定试剂包括封闭液、缓冲液、固定液、透化液、染色液和封片剂。采用上述技术方案，所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒中，所述染色液包括多种免疫荧光染色单克隆抗体。采用上述各个技术方案，所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒中，所述免疫荧光染色单克隆抗体为CK、CEA、CA72-4、CD45。采用上述各个技术方案，所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒中，所述封片剂含有细胞核染料。采用上述各个技术方案，所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒中，所述细胞核染料为DAPI。一种胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测方法，包括如下步骤：S1、CTCs分离：将CTCs分离试剂与含有CTCs的血液样本混合，使免疫磁珠与CTCs结合，去除液体后得到分离的CTCs；S2、CTCs鉴定：将分离的CTCs与CTCs鉴定试剂混合，观察细胞染色情况，计算血液样本中的CTCs数目。采用上述技术方案，所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测方法中，所述S2中，还包括如下步骤：S21、将分离后的CTCs加入固定液；S22、去除固定液，加入缓冲液洗涤；S23、去除缓冲液，加入封闭液；S24、去除封闭液，加入透化液；S25、去除透化液，加染色液；S26、去除染色液，加入缓冲液洗涤；S27、洗涤后的CTCs再加入缓冲液，并转移到载玻片上；S28、去除缓冲液，滴加一滴封片剂，盖上盖玻片，用指甲油封片。S29、在荧光显微镜下观察细胞染色情况，计算CK/CEA/CA7-24+、CD45-、DAPI+细胞的总数目，作为样本中CTCs细胞的数目。采用上述各个技术方案，所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测方法中，所述S21中，固定液为50μl；所述S22中，缓冲液为100μl；所述S23中，封闭液为50μl；所述S24中，透化液50μl；所述S25中，染色液为50μl；所述S26中，缓冲液为100μl；所述S27中，缓冲液为50μl。采用上述各个技术方案，所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测方法中，所述S21中，固本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于：包括CTCs分离试剂和CTCs鉴定试剂；所述CTCs分离试剂包括偶联EpCAM和CSV单克隆抗体包被的免疫磁珠，所述CTCs鉴定试剂包括封闭液、缓冲液、固定液、透化液、染色液和封片剂。/n
【技术特征摘要】
1.一种胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于：包括CTCs分离试剂和CTCs鉴定试剂；所述CTCs分离试剂包括偶联EpCAM和CSV单克隆抗体包被的免疫磁珠，所述CTCs鉴定试剂包括封闭液、缓冲液、固定液、透化液、染色液和封片剂。
2.根据权利要求1所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于：所述染色液包括多种免疫荧光染色单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于：所述免疫荧光染色单克隆抗体为CK、CEA、CA72-4、CD45。
4.根据权利要求1所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于：所述封片剂含有细胞核染料。
5.根据权利要求4所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测试剂盒，其特征在于：所述细胞核染料为DAPI。
6.一种胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、CTCs分离：将CTCs分离试剂与含有CTCs的血液样本混合，使免疫磁珠与CTCs结合，去除液体后得到分离的CTCs；
S2、CTCs鉴定：将分离的CTCs与CTCs鉴定试剂混合，观察细胞染色情况，计算血液样本中的CTCs数目。
7.根据权利要求6所述的胃肠道恶性肿瘤循环肿瘤细胞检测方法，其特征在于：所述S2中，还...
【专利技术属性】
技术研发人员：张磊，王四化，
申请(专利权)人：深圳天烁生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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