一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽探针及制备方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体涉及一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽探针及制备方法。本发明专利技术提供的单链胶原多肽探针中间含有(Gly‑Pro‑Hyp)n、(Gly‑Pro‑Pro)n或(Gly‑Hyp‑Hyp)n的重复序列，序列上修饰有荧光信号分子，序列的C端包含数个带电荷的氨基酸。本发明专利技术提供的新型多肽探针不含有非天然氨基酸，制备简单。该新型多肽探针具有pH敏感性，在酸性条件下形成三重螺旋结构，而在生理pH条件下，则可以保持稳定的单链结构，不需要经过任何预处理，即具有特异性结合病变胶原蛋白的能力，并且完全避免了预处理对组织样品的损伤风险。本发明专利技术提供的新型多肽探针，可用于体外检测病变胶原蛋白的含量，在肿瘤等胶原相关疾病的早期诊断与疗效评价中具有广阔的应用前景。

A single strand collagen peptide probe induced by charge rejection and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽探针及制备方法
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针及其制备方法。
技术介绍
胶原蛋白作为哺乳动物体内含量最多的蛋白质，是细胞外基质的主要组成成分，在组织形成和维持体内平衡中发挥关键作用。人体的正常发育和组织修复中存在胶原重塑的过程，即天然胶原的三螺旋结构在蛋白水解酶或其他外力的作用下会发生形变或降解，若在胶原重塑过程中，胶原产生过多，则过量的胶原会在器官中累积，容易产生组织纤维化，最终导致肿瘤等严重疾病；若胶原发生不可控的降解，则会导致胶原蛋白退化性疾病，如关节炎等。因此，如何快速准确的检测机体组织中的病变胶原蛋白的含量，对于预防和治疗胶原蛋白病变相关的疾病具有重要意义。靶向识别技术是实现肿瘤等疾病的早期检测和精确诊断的关键技术，在生物医学领域应用广泛。而胶原蛋白同时参与调控细胞的增殖、分化和迁移等基本生命活动，并与成骨不全症、关节炎、肿瘤等重大疾病息息相关，可作为人体众多疾病的关键生物标记物。因此，实现对胶原蛋白的靶向检测对这些疾病的早期诊断和治疗至关重要。目前，对于机体组织中的病变胶原蛋白含量的检测主要通过抗体抗原免疫法或传统染料为核心的试剂盒来检测，包括HE染色法、V.G染色法和Masson染色法等。这些方法可以实现胶原纤维染色，但是，它们通常步骤复杂，染色过程会对组织造成破坏，染色之后的组织不易用于其它染色。并且，这些方法会检测所有的胶原蛋白，包括正常的胶原蛋白，而不能特异性的专一检测组织中的病变胶原蛋白。随着探针技术的不断进展，目前已发现一些靶向识别胶原蛋白的多肽探针，包括天然氨基酸多肽和非天然氨基酸多肽，可用于体外胶原蛋白的识别及成像。非天然氨基酸多肽的合成成本较高，并且应用于体内检测会存在安全隐患，因此完全由天然氨基酸组成的多肽探针成为研究热点。研究发现，由GPO(Gly-Pro-Hyp)或GPP(Gly-Pro-Pro)重复序列组成的天然氨基酸多肽，可特异性结合病变胶原蛋白。中国专利CN107266562A公开了一种识别病变胶原蛋白的多肽探针，该探针在GPO或GPP的重复序列上修饰荧光物质，在常温条件下容易形成三重螺旋结构；然而，三重螺旋结构会导致多肽探针丧失胶原蛋白的靶向结合能力。因此，具有三重螺旋结构的多肽探针，必须在使用前进行高温等前处理，使其保持单链状态，才能够靶向结合胶原蛋白。但是，高温等前处理过程容易导致待测组织损伤，会影响检测结果的准确性。针对现有技术存在的问题，专利技术人经过多次试验研究发现，在含有多个GPO重复序列的多肽上引入数个带电荷的氨基酸，获得的新型多肽探针在生理pH环境下具有显著的单链稳定性，而在酸性条件下则形成三重螺旋结构。该多肽序列修饰信号分子后，可作为多肽探针用于病变胶原蛋白的靶向检测。与现有的胶原靶向的多肽探针相比，该pH敏感的新型多肽探针，在生理条件下，可以保持稳定的单链结构，不需要经过任何预处理，即具有特异性结合病变胶原蛋白的能力。该新型多肽探针无非天然氨基酸，制备简单，而且完全避免了预处理对组织样品的损伤风险。该新型多肽探针，可用于体外检测病变胶原蛋白的含量，在肿瘤等胶原相关疾病的早期诊断与疗效评价中具有广阔的应用前景。
技术实现思路
针对现有技术中的不足，本专利技术的目的在于提供一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽探针，该胶原多肽能够在生理pH环境下保持稳定的单链结构，不需要预处理，即可与病变胶原蛋白特异性结合。本专利技术的目的通过以下技术方案实现：一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽探针，所述单链胶原多肽探针中间含有数个(Gly-Pro-Hyp)、(Gly-Pro-Pro)或(Gly-Hyp-Hyp)的多肽序列，所述多肽序列上修饰功能物质；所述多肽序列的C端连有带电荷的氨基酸序列Z，以促使多肽保持单链非折叠结构。优选地，所述胶原多肽探针的序列为X-(Gly-Pro-Hyp)a-Z(a为4-20之间的整数)，X-(Gly-Pro-Pro)a-Z(a为4-20之间的整数)，X-(Gly-Hyp-Hyp)a-Z(a为4-20之间的整数)，(Gly-Pro-Hyp)a-Gly-Pro-Amp(-X)-(Gly-Pro-Hyp)b-Z(a和b为1-20之间的整数)、(Gly-Pro-Pro)a-Gly-Pro-Amp(-X)-(Gly-Pro-Pro)b-Z(a和b为1-20之间的整数)或(Gly-Hyp-Hyp)a-Gly-Pro-Amp(-X)-(Gly-Hyp-Hyp)b-Z(a和b为1-20之间的整数)中的一种；其中X为功能物质，Gly为甘氨酸，Pro为脯氨酸，Hyp为羟脯氨酸，Amp为4-氨基脯氨酸，Z为富含带电荷氨基酸的序列。优选地，所述功能物质X为荧光素类分子、香豆素类分子、罗丹明类分子、菁染料类分子、BODIPY类分子、方酸类分子、磷光分子、半导体量子点、碳量子点、硅量子点、硫量子点、磷量子点、钙钛矿量子点、贵金属团簇、上转化稀土纳米材料、长余辉纳米材料、石墨烯、氧化石墨烯、二硫化钼、二硫化钨、二氧化锰、氮化硼、碳纳米管、四氧化三铁纳米粒子、氧化铁纳米粒子、硅纳米粒子、贵金属纳米粒子、MOF材料、硅球、脂质体和磁珠中的一种或几种；所述功能物质连接在胶原多肽的N端，或通过胶原多肽某一中间位置的Amp(4-氨基脯氨酸)的侧链连接。优选地，所述功能物质X为羧基荧光素FAM或羧基-X罗丹明6-ROX。优选地，所述功能物质X与多肽序列通过接头Ahx连接。优选地，所述序列Z包含1-15个相同或不同带电荷的氨基酸或氨基酸带电衍生物。优选地，所述序列Z包含1-6个带电荷的氨基酸。优选地，所述带电荷的氨基酸为D。优选地，所述单链胶原多肽探针中间含有1-15个(Gly-Pro-Hyp)、(Gly-Pro-Pro)或(Gly-Hyp-Hyp)重复序列。优选地，所述单链胶原多肽探针中间含有7个(Gly-Pro-Hyp)。本专利技术的另一目的在于提供一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽探针的制备方法，所述方法包括以下步骤：a)将80-250mg的树脂加入具有筛板的反应器中，使用2-8mL二氯甲烷溶胀树脂；b)由15-25％哌啶/N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液脱除N端Fmoc保护基，通过显色反应来检测保护基的脱除程度；c)将N端由Fmoc保护的氨基酸(4eq)与HOBt(4eq)和HBTU(4eq)由DMF溶解，低温活化10-30min后，向溶液中滴加DIEA(6eq)，溶液混合均匀后加入到反应器中，反应1-6hrs；d)反应结束后，反应液由反应器中抽出，树脂分别由2-8mLDMF和DCM洗2-4次，显色反应检测氨基酸缩合完全，树脂由15-25％哌啶/DMF溶液处理3次，分别为5min、5min和15min，树脂分别由5mLDMF和DCM洗3次，显色反应检测保护基脱除完全；e)之后重复步骤c)和d)，直到合成目标序列的胶原多肽后；f)称取功能物质(4eq)、HOBt(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针，其特征在于：所述单链胶原多肽功能探针中间含有数个(Gly-Pro-Hyp)n、(Gly-Pro-Pro)n或(Gly-Hyp-Hyp)n重复序列；多肽序列连接修饰功能物质；多肽序列在C端包含数个带电荷的氨基酸，以促使多肽保持单链非折叠结构。/n

【技术特征摘要】
20190214 CN 20191011352631.一种电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针，其特征在于：所述单链胶原多肽功能探针中间含有数个(Gly-Pro-Hyp)n、(Gly-Pro-Pro)n或(Gly-Hyp-Hyp)n重复序列；多肽序列连接修饰功能物质；多肽序列在C端包含数个带电荷的氨基酸，以促使多肽保持单链非折叠结构。


2.根据权利要求1所述的电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针，其特征在于：所述胶原多肽探针的序列为X-(Gly-Pro-Hyp)a-Z(a为4-20之间的整数)，X-(Gly-Pro-Pro)a-Z(a为4-20之间的整数)，X-(Gly-Hyp-Hyp)a-Z(a为4-20之间的整数)，(Gly-Pro-Hyp)a-Gly-Pro-Amp(-X)-(Gly-Pro-Hyp)b-Z(a和b为1-20之间的整数)、(Gly-Pro-Pro)a-Gly-Pro-Amp(-X)-(Gly-Pro-Pro)b-Z(a和b为1-20之间的整数)或(Gly-Hyp-Hyp)a-Gly-Pro-Amp(-X)-(Gly-Hyp-Hyp)b-Z(a和b为1-20之间的整数)中的一种；其中X为功能物质，Gly为甘氨酸，Pro为脯氨酸，Hyp为羟脯氨酸，Amp为4-氨基脯氨酸，Z为富含带电荷氨基酸的序列。


3.根据权利要求2所述的电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针，其特征在于：所述功能物质为荧光素类分子、香豆素类分子、罗丹明类分子、菁染料类分子、BODIPY类分子、方酸类分子、磷光分子、半导体量子点、碳量子点、硅量子点、硫量子点、磷量子点、钙钛矿量子点、贵金属团簇、上转化稀土纳米材料、长余辉纳米材料、石墨烯、氧化石墨烯、二硫化钼、二硫化钨、二氧化锰、氮化硼、碳纳米管、四氧化三铁纳米粒子、氧化铁纳米粒子、硅纳米粒子、贵金属纳米粒子、MOF材料、硅球、脂质体和磁珠中的一种或几种；所述功能物质连接在胶原多肽的N端，或通过胶原多肽某一中间位置的Amp(4-氨基脯氨酸)的侧链连接。


4.根据权利要求1所述的电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针，其特征在于：所述C端富含带电荷氨基酸的序列包含1～15个相同或不同的带电荷的氨基酸或氨基酸带电衍生物。


5.根据权利要求1所述的电荷排斥作用诱导的单链胶原多肽功能探针，...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖建喜，蔡向东，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62