脂质过氧化诱发性疾病的治疗药物及其筛选方法技术

本发明专利技术提供一种使用由式(I)所示的化合物作为荧光探针分子且用于检测被测化合物的脂质过氧化抑制的活性的检定方法、利用该检定方法的检定试剂盒、使用该检定方法的筛选方法、以及用于治疗脂质过氧化反应诱发性疾病(例如，年龄相关性黄斑变性)等的医药组合物。

Drugs for the treatment of lipid peroxidation induced diseases and their screening methods

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】脂质过氧化诱发性疾病的治疗药物及其筛选方法
本专利技术提供一种用于寻找脂质过氧化抑制剂的检定方法、检定试剂盒、其筛选方法、以及脂质过氧化诱发性疾病的治疗药物。
技术介绍
脂质过氧化(lipidperoxidation)反应中的脂质自由基所参与的疾病涉及心血管系统、中枢系统、呼吸系统、以及抗菌药物等广泛的疾病领域(非专利文献1)(参照图1)。然而，在起因于脂质过氧化反应的疾病中，对于每种疾病参与大量的脂质过氧化物及其代谢产物，因此，不容易找到对于每种疾病有用的治疗药物。迄今为止，虽然已知有许多抗氧化物质，但被批准为医药品的物质少。因此，需要提供一种示出脂质过氧化反应的抑制效果的药物。作为寻找活性药物的方法，已知有筛选(screening)方法。作为对脂质过氧化反应的抑制进行测定的方法，已知有几种方法(例如，TBARs法)。然而，就这些方法而言，测定对象多种多样，另外，在利用荧光或吸光原理时存在不能测定吸收波长不同的样品的问题，或者，存在pH操作、加热等操作烦杂等问题。于是，需要构建一种专门用于脂质过氧化反应的检测且能够在接近生物体的温和条件下分析多种试料的系统的检定(assay)方法。迄今为止，本专利技术的专利技术人等一直在开发能够捕获脂质自由基的优良的荧光硝基氧(nitroxide)探针(probe)化合物(专利文献1)。已知年龄相关性黄斑变性(AMD)是治疗满意度和药剂对于治疗的贡献度低且未得到满足的医疗需求(UnmetMedicalNeeds)高的疾病。就年龄相关性黄斑变性而言，从其发病机理来讲大致分为萎缩型(干型)和渗出型(湿型)两种。在美国，萎缩型(干型)的患者约有85～90％之多，另一方面，在日本，渗出型(湿型)的患者约有92％之多。然而，尚未知晓对萎缩型(干型)疾病有效的治疗药物。另外，尚未从抗氧化物质开发出对年龄相关性黄斑变性的治疗以及进展抑制有效的治疗药物。在先技术文献专利文献专利文献1：日本专利申请2017-090739非专利文献非专利文献1：FrijhoffJetal.,Antioxid.RedoxSignal,2015,23(14),1144-70
技术实现思路
专利技术所要解决的问题本专利技术提供一种使用荧光硝基氧探针(nitroxideprobe)化合物的检测脂质过氧化抑制所用的检定方法(assaymethod)、检定试剂盒(assaykit)、以及使用这些检定方法的筛选方法(screeningmethod)。另外，提供一种使用通过本专利技术的筛选方法来发现的活性药物的、用于治疗脂质过氧化反应诱发性疾病(diseasesinducedbylipidperoxidationreactions)例如年龄相关性黄斑变性等的医药组合物等。用于解决问题的方案本专利技术人等专心研究了用于检测、评价脂质过氧化抑制的检定方法以及筛选方法，其结果，发现使用荧光硝基氧探针化合物的检定方法以及使用该检定方法的筛选方法能够容易地寻找示出脂质过氧化抑制活性的候选化合物。另外，本专利技术人等还发现这些候选化合物对起因于脂质过氧化反应的疾病尤其对年龄相关性黄斑变性的治疗或预防有用。即、本专利技术提供以下的方式，但并不限定于此。(检定试剂盒及检定方法)项[1]：一种检定试剂盒，用于检测被测化合物的脂质过氧化抑制的活性，所述检定试剂盒在缓冲液中包含由式(I)所示的化合物、脂质体、以及选自由2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐和二价铁离子供给源物质组成的组中的至少一种化合物，其中，式(I)如下：[化1]项[1-2]：在项[1]所述的检定试剂盒中，由该式(I)所示的化合物的浓度为1.0～20.0μM，脂质体由以蛋黄为来源的磷脂酰胆碱和双十六烷基磷酸酯配制，该以蛋黄为来源的磷脂酰胆碱的浓度为5.0～10.0mg/mL，该双十六烷基磷酸酯的浓度为0.01～1.0mg/mL，被测化合物的浓度为5～100μM，2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐的浓度为5～50mM，二价铁供给源的浓度为0.5～5mM。项[2]：在项[1]所述的检定试剂盒中，二价铁离子供给源物质是硫酸铁(Ⅱ)。项[3]：在权利要求1或2所述的检定试剂盒中，包括示出化合物的活性值的附加说明书，其中，所述化合物示出脂质过氧化抑制的活性。项[4]：一种检定试剂盒，用于检测被测化合物的脂质过氧化抑制的活性，所述检定试剂盒在缓冲液中包含由式(I)所示的化合物、培养细胞、以及选自由花生四烯酸和过氧化氢叔丁基组成的组中的至少一种化合物，其中，式(I)如下：[化2]项[4-2]：在项[4]所述的检定试剂盒中，由该式(I)所示的化合物的浓度为1.0～20.0μM，培养细胞的浓度为1×104～1×105细胞数，被测化合物的浓度为5～500μM，花生四烯酸的浓度为100～400μM，过氧化氢叔丁基的浓度为100～400μM。项[5]：在项[4]所述的检定试剂盒中，培养细胞是以人肝脏为来源的HepG2细胞。项[6]：在项[4]或[5]所述的检定试剂盒中，包括示出化合物的活性值的附加说明书，其中，所述化合物示出脂质过氧化抑制的活性。项[7]：一种检定试剂盒，包含项[1]～[6]中所述的任意两种或其以上的检定试剂盒。项[7-2]：在项[7]所述的检定试剂盒中，包含反应引发剂为2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐的检定试剂盒和反应引发剂为硫酸铁(Ⅱ)的检定试剂盒的组合。项[7-3]：在项[7]所述的检定试剂盒中，包含反应引发剂为花生四烯酸的检定试剂盒和反应引发剂为过氧化氢叔丁基的检定试剂盒的组合。项[8]：一种用于测定脂质过氧化抑制活性的检定方法，包括：ⅰ)配制包含由式(I)所示的化合物和脂质体的缓冲液；ⅱ)添加选自由2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐和二价铁离子供给源物质组成的组中的至少一种化合物；ⅲ)添加被测化合物；ⅳ)测定荧光；以及，ⅴ)从荧光测定结果求出被测化合物的活性值。项[9]：一种用于测定脂质过氧化抑制活性的检定方法，包括：ⅰ)配制包含由式(I)所示的化合物和培养细胞的缓冲液；ⅱ)添加选自由花生四烯酸和过氧化氢叔丁基组成的组中的至少一种化合物；ⅲ)添加被测化合物；ⅳ)测定荧光；以及，ⅴ)从荧光测定结果求出被测化合物的活性值。项[10]：在项[8]或[9]所述的检定方法中，包括：ⅵ)与成为脂质过氧化抑制活性指标的化合物的活性值进行比较。项[11]：根据项[8]～[10]中任一项所述的检定方法，在微孔板使用所述检定方法。项[11-2]：在项[11]所述的检定方法中，包括：ⅰ)将被测化合物的溶液分配到微孔板中；ⅱ)将包含由式(I)所示的化合物、和脂质体或培养细胞的溶液分配到各孔中；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检定试剂盒，用于检测被测化合物的脂质过氧化抑制的活性，所述检定试剂盒的特征在于，/n在缓冲液中包含由式(I)所示的化合物、脂质体、以及选自由2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐和二价铁离子供给源物质组成的组中的至少一种化合物，/n其中，式(I)如下：/n[化1]/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170706 JP 2017-1327721.一种检定试剂盒，用于检测被测化合物的脂质过氧化抑制的活性，所述检定试剂盒的特征在于，
在缓冲液中包含由式(I)所示的化合物、脂质体、以及选自由2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐和二价铁离子供给源物质组成的组中的至少一种化合物，
其中，式(I)如下：
[化1]





2.根据权利要求1所述的检定试剂盒，其特征在于，
二价铁离子供给源物质是硫酸铁(Ⅱ)。


3.根据权利要求1或2所述的检定试剂盒，其特征在于，
包括示出化合物活性值的附加说明书，其中，所述化合物示出脂质过氧化抑制的活性。


4.一种检定试剂盒，用于检测被测化合物的脂质过氧化抑制的活性，所述检定试剂盒的特征在于，
在缓冲液中包含由式(I)所示的化合物、培养细胞、以及选自由花生四烯酸和过氧化氢叔丁基组成的组中的至少一种化合物，其中，式(I)如下：
[化2]





5.根据权利要求4所述的检定试剂盒，其特征在于，
培养细胞是以人肝脏为来源的HepG2细胞。


6.根据权利要求4或5所述的检定试剂盒，其特征在于，
包括示出化合物活性值的附加说明书，其中，所述化合物示出脂质过氧化抑制的活性。


7.一种检定试剂盒，其特征在于，
包含权利要求1至6中的任意两种或其以上的检定试剂盒。


8.一种用于测定脂质过氧化抑制的活性的检定方法，其特征在于，包括：
ⅰ)配制包含由式(I)所示的化合物和脂质体的缓冲液；
ⅱ)添加选自由2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐和二价铁离子供给源物质组成的组中的至少一种化合物；
ⅲ)添加被测化合物；
ⅳ)测定荧光；以及，
ⅴ)从荧光测定结果求出被测化合物的活性值。


9.一种用于测定脂质过氧化抑制的活性的检定方法，其特征在于，包括：
ⅰ)配制包含由式(I)所示的化合物和培养细胞的缓冲液；
ⅱ)添加选自由花生四烯酸和过氧化氢叔丁基组成的组中的至少一种化合物；
ⅲ)添加被测化合物；
ⅳ)测定荧光；以及，
ⅴ)从荧光测定结果求出被测化合物的活性值。


10.根据权利要求8或9所述的检定方法，其特征在于，
包括：ⅵ)与成为脂质过氧化抑制活性的指标的化合物的活性值进行比较。


11.根据权利要求8至10中任一项所述的检定方法，其特征在于，
在微孔板使用所述检定方法。


12.一种用于选择脂质过氧化抑制活性高的候选化合物的筛选方法，其特征在于，包括：
ⅰ)从化合物库中选择被测化合物；
ⅱ)进行借助于使用被测化合物的、使用权利要求8中所述的2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐的检定方法的筛选，选择示出高活性值的化合物；以及，
ⅲ)接下来，进行借助于使用ⅱ)的示出了高活性值的化合物的、使用权利要求8中所述的二价铁离子供给源物质的检定方法的筛选，选择示出高活性值的化合物。


13.根据权利要求12所述的筛选方法，其特征在于，
在化合物库是包含未被批准为食品或医药品的化合物的化合物库的情况下，在权利要求12中所述的筛选方法的基础上进一步包括：
ⅰ)进行借助于权利要求9中所述的、使用花生四烯酸的检定方法的筛选，选择示出高活性值的化合物；
ⅱ)进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：山田健一，进藤早纪，井手友美，山本启一，
申请(专利权)人：扶桑药品工业株式会社，山田健一，
类型：发明
国别省市：日本;JP