重组酵母细胞制造技术

本发明专利技术描述了一种重组酵母细胞，所述重组酵母细胞功能性表达一种或多种异源核酸序列，该一种或多种异源核酸序列编码核酮糖‑1,5‑磷酸羧化酶/加氧酶(EC4.1.1.39；Rubisco)和任选的一种或多种Rubisco分子伴侣以及一种或多种磷酸核酮糖激酶(EC2.7.1.19；PRK)，其中戊糖磷酸途径的非氧化分支的一种或多种基因过表达，和/或其中所述酵母细胞包含甘油‑3‑磷酸脱氢酶(GPD)基因的缺失或破坏。

Recombinant yeast cell

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】重组酵母细胞
本专利技术涉及一种具有产生期望发酵产物的能力的重组酵母细胞，涉及异源肽在酵母细胞中的功能性表达，并且涉及一种其中使用所述酵母细胞的用于产生发酵产物的方法。
技术介绍
微生物发酵方法被应用于从可再生碳水化合物原料工业生产广泛且快速扩展范围的化学化合物。尤其是在厌氧发酵过程中，辅因子对NADH/NAD+的氧化还原平衡可造成对产物产量的重大约束。该挑战的例子是在-例如-由Saccharomycescerevisiae进行的燃料乙醇的工业生产中形成甘油作为主要副产物，这是需要对在生物合成反应中形成的NADH进行再氧化的直接结果。由Saccharomycescerevisiae进行的乙醇生产是目前工业生物技术中按体积计的一个最大的发酵工艺，但目前在工业生物技术工艺中还产生了各种其他化合物，包括其他醇、羧酸，类异戊二烯，氨基酸等。已经提出了多种方法来通过遗传修饰改善工业生物技术中所使用的生物的发酵性质。与基于酵母的乙醇以及其他化合物的生产的化学计量有关的主要挑战是大量的NADH依赖性副产物(特别是甘油)通常作为副产物形成，特别是在厌氧和氧受限条件下或在呼吸以其他方式受到限制或不存在的条件下。据估计，在典型的工业乙醇工艺中，高达约4重量％的糖原料被转化为甘油(Nissen等人，Yeast16(2000)463-474)。在厌氧生长的理想条件下，甘油转化率甚至可以更高，高达约10％。厌氧条件下的甘油生产主要与氧化还原代谢有关。在S.cerevisiae的厌氧生长期间，经由醇发酵而发生糖异化。在该方法中，在糖酵解甘油醛-3-磷酸脱氢酶反应中形成的NADH通过转化乙醛而被再氧化，该乙醛是经由NAD+依赖性醇脱氢酶将丙酮酸脱羧成乙醇而形成的。当在代谢中的其他地方发生NAD+至NADH的净还原时，该氧化还原-中性异化途径的固定化学计量引起问题。在厌氧条件下，S.cerevisiae中的NADH再氧化严格依赖于将糖还原成甘油。甘油形成通过将糖酵解中间体二羟丙酮磷酸(DHAP)还原成甘油3-磷酸(甘油-3P)而引发，这是由NAD+依赖性甘油3-磷酸脱氢酶催化的反应。随后，在该反应中形成的甘油3-磷酸被甘油-3-磷酸酶水解，以得到甘油和无机磷酸盐。因此，甘油是由S.cerevisiae进行的乙醇厌氧生产期间的主要副产物，甘油为不希望的，因为其降低了糖到乙醇的总转化率。此外，乙醇生产设施的流出物中甘油的存在可导致废水处理的成本。WO2014/129898描述了编码核酮糖-1，5-磷酸羧化酶/加氧酶(EC4.1.1.39；本文缩写为“Rubisco”)，和任选的Rubisco分子伴侣，以及磷酸核酮糖激酶(EC2.7.1.19；本文缩写为“PRK”)的功能性异源核酸序列的重组细胞。WO2015107496描述了编码核酮糖-1，5-磷酸羧化酶/加氧酶单元RbcL、RbcS和RcbX，Rubisco分子伴侣GroEL和GroES的功能性异源核酸序列的重组细胞。在示例中，用四环素诱导型启动子TetO7表达PRK，参见表5。因此，该启动子需要方法助剂，即向增殖中加入化合物，这增加了方法的成本和复杂性。所述化合物是强力霉素，强力霉素为一种抗生素，其在乙醇发酵过程中不优选作为添加剂。尽管WO2014/129898中描述的方法是有利的，但是持续需要改进，特别是改进诸如乙醇的有用有机化合物的生产。另外，期望提供一种微生物，在所述微生物中NADH依赖性副产物被进一步降低。还期望一种不需要诸如抗生素的添加剂的方法。此外，期望改善菌株的增殖特性。这些包含在本专利技术的目的中。附图说明图1：工程菌株的耐渗透性测定。使细胞在合成培养基(180gL-1(1M)葡萄糖，初始pH6)上生长，并在厌氧条件(10％CO2)下于30℃孵育48小时。A：IME324(GPD1GPD2)；B：IMX1443(GPD1gpd2ΔpDAN1-prkcbbm非氧化PPP↑，二倍体)；C：IMX1489(GPD1gpd2ΔpDAN1-prkcbbm非氧化PPP↑，单倍体。专利技术概述根据本专利技术实现了上述目的中的一个或多个目的，本专利技术提供了一种重组酵母细胞，该重组酵母细胞功能性表达一种或多种异源核酸序列，该一种或多种异源核酸序列编码核酮糖-1，5-磷酸羧化酶/加氧酶(EC4.1.1.39；Rubisco)和任选的一种或多种Rubisco分子伴侣以及一种或多种磷酸核酮糖激酶(EC2.7.1.19；PRK)，其中戊糖磷酸途径的非氧化分支的一种或多种基因过表达，和/或其中所述酵母细胞包含甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)基因的缺失或破坏。有利地，，此类重组酵母细胞具有提高的产物收率和/或减少的副产物形成和/或改善的增殖特性和/或不存在对于发酵过程的诸如抗生素的添加剂，因此不需要改变常规的发酵过程。专利技术详述因此，本专利技术涉及一种重组酵母细胞，该重组酵母细胞功能性表达一种或多种异源核酸序列，该一种或多种异源核酸序列编码核酮糖-1，5-磷酸羧化酶/加氧酶(EC4.1.1.39；Rubisco)和任选的一种或多种Rubisco分子伴侣以及一种或多种磷酸核酮糖激酶(EC2.7.1.19；PRK)，其中戊糖磷酸途径的非氧化分支的一种或多种基因过表达，和/或其中所述酵母细胞包含甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)基因的缺失或破坏。GPD基因可以是GPD1和/或GPD2基因。GPD1和GPD2基因均可以缺失或破坏，但是优选的是GPD2而不是GPD1被缺失或破坏。GPD基因编码具有至少EC编号1.1.1.8的酶。WO2011/010923描述了如何缺失或破坏甘油-3-磷酸脱氢酶的方法。在一个实施方式中，过表达的戊糖磷酸途径的一种或多种基因编码选自以下列表的酶：转醛醇酶(EC2.2.1.2)、转酮醇酶(EC2.2.1.1)、核糖-5-磷酸异构酶(EC5.3.1.6)和D-核酮糖-5-磷酸3-表异构酶(EC5.1.3.1)。在另一实施方式中，过表达的戊糖磷酸途径的一种或多种基因选自以下列表：TAL1、TAL2、NQM1、TKL1、TKL2、RPE1和RKI1。在一个实施方式中，PRK处于启动子(在此为“PRK启动子”)的控制下，其PRK表达比厌氧/需氧为2或更高，并且Rubisco处于组成型启动子的控制下。在一个实施方式中，PRK启动子是ROX1阻抑的。ROX1在本文中是缺氧基因(hypoxicgene)的血红素依赖性阻遏物；介导对缺氧诱导基因如COX5b和CYC7的有氧转录阻抑；通过响应于氧化应激减少启动子占据来调控阻遏物功能；并且含有负责DNA弯曲活性的HMG结构域；参与高渗应激抗性。ROX1受氧调控。在一个实施方式中，PRK启动子是ROX1阻抑的。在一个实施方式中，PRK启动子具有一个或多个ROX1结合基序。在一个实施方式中，PRK启动子在其序列中包含一个或多个基序NNNATGTTNNN。在一个实施方式中，PRK启动子是选自由以下项组成的列表的基因的天然启动子：FET4、ANB1、YHR048W、DAN1、AAC3、TIR2、DIP5、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组酵母细胞，所述重组酵母细胞功能性表达一种或多种异源核酸序列，所述一种或多种异源核酸序列编码核酮糖-1,5-磷酸羧化酶/加氧酶(EC4.1.1.39；Rubisco)和任选的一种或多种Rubisco分子伴侣，并且还包含一种或多种磷酸核酮糖激酶(EC2.7.1.19；PRK)，其中戊糖磷酸途径的非氧化分支的一种或多种基因过表达。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170613 EP 17175637.2;20171130 EP 17204602.1;20181.一种重组酵母细胞，所述重组酵母细胞功能性表达一种或多种异源核酸序列，所述一种或多种异源核酸序列编码核酮糖-1,5-磷酸羧化酶/加氧酶(EC4.1.1.39；Rubisco)和任选的一种或多种Rubisco分子伴侣，并且还包含一种或多种磷酸核酮糖激酶(EC2.7.1.19；PRK)，其中戊糖磷酸途径的非氧化分支的一种或多种基因过表达。


2.根据权利要求1所述的重组酵母细胞，所述重组酵母细胞还包含甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)基因的缺失或破坏。


3.根据权利要求1或2所述的重组酵母细胞，其中所述戊糖磷酸途径的非氧化分支的一种或多种基因过表达，并且其中所述酵母细胞包含甘油-3-磷酸脱氢酶(GPD)基因的缺失或破坏。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组酵母细胞，其中所述GPD基因编码具有至少EC编号1.1.1.8的酶。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组酵母细胞，其中所述GDP为GPD1和/或GPD2，优选地GPD2。


6.根据权利要求1至5中任一项所述的重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：扬尼斯·帕帕彼得里迪斯，雅各布斯·托马斯·普龙克，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL