本发明专利技术涉及微生物技术领域，具体涉及一种逆转肿瘤细胞多药耐药性为敏感性的红棕毛筒腔菌。该菌株已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日：2019.11.20，保藏登记号为CCTCC M 2019957 PF02‑2。本发明专利技术提供了红棕毛筒腔菌PF02‑2发酵获得活性代谢产物的方法；该代谢产物具有逆转肿瘤细胞多药耐药性为敏感性的活性，致使肿瘤细胞对药物重新敏感，有助于抗肿瘤药物发挥药效，为医用药物新来源的开发增添了新的途径。
The application of Chaetomium rubrum in the preparation of drugs for reversing multidrug resistance of tumor
【技术实现步骤摘要】
红棕毛筒腔菌在制备逆转肿瘤多药耐药性为敏感性的药物中的应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及红棕毛筒腔菌在制备逆转肿瘤多药耐药性为敏感性的药物中的应用。
技术介绍
肿瘤多药耐药(MultidrugResistance,MDR)是指肿瘤细胞不仅对一种抗肿瘤药物产生耐药,而且对其他结构不同、作用机制各异的抗肿瘤药物亦产生交叉耐药现象。尽管肿瘤治疗的研究不断进步,但是仅有不到50％肿瘤对化疗敏感，超过50％的肿瘤对化疗药物迅速产生耐药，一旦耐药产生，医生将束手无策。因此，寻找低毒高效的肿瘤耐药逆转剂已是肿瘤化疗药物领域研究的热点。P-糖蛋白(P-gp)是ABC转运蛋白家族最具有代表性的蛋白之一。P-gp结构为同源二聚体，每个单体由两束α螺旋和两个核苷酸结合区构成，分子量为170kD，由1280个氨基酸残基组成。P-gp与药物的结合口袋主要位于α螺旋区。核苷酸结合区的功能为与ATP结合，为P-gp与底物的结合和转运过程提供能量。研究表明，P-gp能够转运化学性质和结构多样性的药物，包括部分抗癌药物，如阿霉素、紫杉烷类等，引起多药耐药(MDR)现象，导致癌症治疗的失败。因此，P-gp抑制剂和底物的研究对于癌症治疗具有重要的意义，可将P-gp抑制剂与化疗药物共同给药作为克服MDR的有效策略。目前，现已经开发了几代P-gp抑制剂，第一代逆转剂包括他莫昔芬、环孢素A等，其中以维拉帕米和环胞菌素为典型代表。因此类药物通常缺乏P-糖蛋白的特异性，会产生严重的副作用，第一代逆转剂也在临床上受到很大程度的限制(SatoW.etal.1991)。第二代逆转剂孢菌素类似物伐司朴达(valspodar，PSC833)、右旋维拉帕米(dexverapamil)等，其中以地塞米松为代表，然而，第二代逆转剂的开发由于高毒性和药物相互作用而产生一系列副作用而受到限制(RowinskyE.K.etal.1998；HyafilF.etal.1993；KellerR.P.etal.1992)。第三代P-糖蛋白抑制剂的主要代表药物有Tariquidar(XR9576)、Zosuquidar(LY335979)、S9788等，其中以Tariquidar(XR9576)和WK-X-34为代表(MasseyP.R.etal.2014)。而从天然产物及其衍生物中开发P-gp抑制剂已成为第四代抑制剂研发的新方向和重点。目前尚未发现从微生物来源的天然产物中开发P-gp抑制剂的具体报道。毛筒壳科真菌绝大部分是在陆生木质基质上生长的腐生菌，也有一部分生长在水生栖息地(BoonmeeS.etal.2014)。近几年来有很多研究发现可以从水生的环境中分离到毛筒壳科真菌(LuoZ.L.etal.2017；ChaiwanN.etal.2017)。已有研究证明这个科的真菌拥有产活性次级代谢产物的巨大潜力(MaoZ.L.etal.2014)。在本课题组的前期研究中，从腐烂的木质基质上采集的毛筒壳科真菌中选取了19株进行研究，采用平板对峙法、生长速率法和MTT法，分别测定了这19株毛筒壳科真菌活体菌株抑菌活性、发酵物抑菌活性以及发酵粗提物对不同的人体肿瘤细胞增殖的抑制作用(《毛筒壳科真菌次级代谢产物生物活性的评价》，范翠等2019年发表)，发现了该科真菌及其次级代谢产物具有良好的活性，前景非常广阔。但是未研究该科真菌在MDR中的应用，因此，本次研究试图通过从毛筒壳科真菌中来筛选有效的多药耐药逆转剂。
技术实现思路
本专利技术为解决上述技术问题，提供了红棕毛筒腔菌在制备逆转肿瘤细胞多药耐药性为敏感性的药物中的应用。具体是通过以下技术方案来实现的：本专利技术所述的红棕毛筒腔菌，是由贵州大学生化工程中心分离获得，命名为红棕毛筒腔菌(TubeufiarubraY.Z.Lu,J.C.Kang&K.D.Hyde)PF02-2菌株，保藏单位：中国典型培养物保藏中心保藏，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日：2019.11.20，保藏登记号为CCTCCM2019957PF02-2。本专利技术的红棕毛筒腔菌(TubeufiarubraY.Z.Lu,J.C.Kang&K.D.Hyde)PF02-2菌株具有下述性质：菌落形态特征：在自然腐木基质上，菌落平展，呈网状、点状，量大时连接成片状，新鲜经分离得到的PF02-2纯菌落上呈无色透明到白色，经分离得到的PF02-2纯菌落自然干燥后呈红棕色。部分菌丝体埋生于基质之下，但多为表生，菌丝体由有隔膜带分枝的菌丝组成，无色至深棕色。分生孢子梗圆柱状，单生，弯曲生长，有隔膜，50-150微米长，4.5-6微米宽，顶端逐渐变细，底部深棕色，顶部透明到浅棕色，表面光滑。产孢细胞单生或多生，圆柱状，具柱状小齿突，合轴生长于分子孢子梗中部到顶部，10-19微米长，3-4微米宽，无色透明状到浅棕色，表面光滑。分子孢子卷旋型，单生，顶侧生，透明，顶端圆形，紧密卷旋时卷曲2-3.5次，直径35-50微米，分生孢子丝3-5微米厚(平均直径45微米，厚度4.5微米)，在水中逐渐松散开，具不清晰的多隔膜，无色到浅棕色，表面光滑。分生孢子在水-琼脂培养基中12h后开始萌发生长。菌落在PDA培养基中置于25-28℃生长2周可达16mm，棕色，呈圆形，表面粗糙，有明显的突出物，呈脉状皱褶，菌落边缘完整。分子生物学特征：采用真菌通用引物ITS5和ITS4对5.8SrRNA基因及ITSrDNA序列进行PCR扩增反应，将PCR扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序，序列提交NCBI获得GenBank登录号为MH558801。采用真菌通用引物LR0R和LR5对28SrRNA基因序列进行PCR扩增反应，将PCR扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序，序列提交NCBI获得GenBank登录号为MH558926。采用真菌通用引物983F和2218R对TEF1α基因序列进行PCR扩增反应，将PCR扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序，序列提交NCBI获得GenBank登录号为MH550994。采用真菌通用引物fRPB2-5F和fRPB2-7cR对RPB2基因序列进行PCR扩增反应，将PCR扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序，序列提交NCBI获得GenBank登录号为MH551128。本专利技术所述的红棕毛筒腔菌PF02-2的来源如下：采样时间：2016年5月14日；采样地点：广西壮族自治区防城港市屏峰雨林自然保护区；采样方式：采集位于广西壮族自治区防城港市屏峰雨林自然保护区的腐木，塑料密封袋带回实验室；本专利技术所述的红棕毛筒腔菌PF02-2样品分离过程为：(1)采集的腐木样品置于显微镜下镜检；(2)接种针消毒，挑取腐木表面白色菌落，转移至40-80μL无菌水中制成孢子悬浮液；(3)将孢子悬浮液转移到5-15mL水-琼脂(简写为WA)平板培养皿中，置于26-30℃中培养10-14小时后，挑取已萌发生长出菌丝的单个分生孢子接种到5-15mL马铃本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.红棕毛筒腔菌在制备逆转肿瘤细胞多药耐药性为敏感性的药物中的应用，其特征在于，所述红棕毛筒腔菌命名为红棕毛筒腔菌(Tubeufia rubra Y.Z.Lu,J.C.Kang&K.D.Hyde)PF02-2，保藏单位：中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日：2019.11.20，保藏登记号为CCTCC M 2019957PF02-2。/n
【技术特征摘要】
1.红棕毛筒腔菌在制备逆转肿瘤细胞多药耐药性为敏感性的药物中的应用，其特征在于，所述红棕毛筒腔菌命名为红棕毛筒腔菌(TubeufiarubraY.Z.Lu,J.C.Kang&K.D.Hyde)PF02-2，保藏单位：中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日：2019.11.20，保藏登记号为CCTCCM2019957PF02-2。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述红棕毛筒腔菌PF02-2由以下方法获得：
(1)经采集的腐木在显微镜下镜检；
(2)接种针消毒，挑取腐木表面白色菌落，转移至40-80μL无菌水中制成孢子悬浮液；
(3)将孢子悬浮液转移到5-15mL水-琼脂平板培养皿中，置于26-30℃中培养10-14小时后，挑取已萌发生长出菌丝的单个分生孢子接种到5-15mL马铃薯葡萄糖琼脂培养皿中，于26-30℃下培养即得PF02-2纯菌落。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述红棕毛筒腔菌PF02-2由以下方法保存：
(1)单孢源菌种悬浮液的制备：在酒精灯火焰旁用灭菌后的接种针或注射用针头从经分离得到的PF02-2纯菌落上挑取分生孢子，置于40-80μL无菌水，混匀形成单孢源菌种悬浮液；
(2)萌发单孢的制备：将步骤(1)所述的孢子悬浮液转移到5-15mL水-琼脂(WA)平板培养皿中，置于25-28℃下，12h后孢子开始萌发生长出菌丝；
(3)保存菌落的制备：将步骤(2)所述的已萌发的单个分生孢子在酒精灯火焰旁于显微操作台上快速转移至5-15mLPDA平板培养皿中，密封带密封后置于26-30℃条件下培养，即得待保存菌落。待该菌落长到直径为3-6cm后转移至1-1.5mLPDA及水-甘油冻存管中，保藏于0-4℃中作为菌种备用。
4.如权利要求1所述红棕毛筒腔菌在制备具有逆转肿瘤多药耐药敏感性药物中的应用，其特征在于，所...
【专利技术属性】
技术研发人员：康冀川，陈丽庄，钱一鑫，卢永仲，范翠，王鲁，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52
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