本发明专利技术公开了一种检测牛奶中黄曲霉毒素M1的时间分辨免疫定量试纸条，属于时间分辨免疫分析快速检测技术领域。本发明专利技术利用竞争免疫法，通过读取荧光定量免疫分析仪上T线的荧光值，即时定量检测分析牛奶样品中的黄曲霉毒素M1。本发明专利技术还提供了一种应用上述试纸条检测乳及乳制品等样品前处理的方法，以期降低基质效应。本发明专利技术试纸条检测黄曲霉毒素毒素M1的方法简单快速，稳定可靠且灵敏度高，适合大量样本的的筛查和现场监控，具有良好的商业化应用前景。
A time-resolved immunoassay strip for the detection of aflatoxin M1 in milk
【技术实现步骤摘要】
一种检测牛奶中黄曲霉毒素M1的时间分辨免疫定量试纸条
本专利技术涉及一种检测牛奶中黄曲霉毒素M1的时间分辨免疫定量试纸条，属于时间分辨免疫分析快速检测
技术介绍
黄曲霉毒素(Aflatoxin，AFT)主要是黄曲霉和寄生曲霉菌的代谢产物，目前已发现20余种，其中黄曲霉毒素B1(AflatoxinB1，AFB1)的毒性、致癌性、污染频率均居于首位。黄曲霉毒素M1(AflatoxinM1，AFM1)是哺乳动物摄入污染了AFB1的饲料后在体内代谢的羟基化产物，常分泌到乳汁中，其毒性仅次于AFB1，WHO将其列为IIB类致癌物。AFM1主要存在于动物的乳、肾脏、肝脏、蛋、肉和尿中，其中以乳中最为常见，物理化学性质相当稳定，不被巴氏消毒法破坏。该毒素一旦进入人或动物体内后，除抑制DNA、RNA合成外，也抑制肝脏蛋白质合成，损害组织器官，致癌、致畸、致突变，引发动物及人类的肝癌、肾癌和胃癌，抑制免疫机能。为控制该毒素对食品的污染，各国制定了严格的限量标准。我国明确规定乳及乳制品中AFM1限量值为0.5μg/kg。欧盟的相关标准更加严格地规定乳及乳制品AFM1的含量不得超过0.05μg/kg，婴儿配方食品中AFM1的含量不得超过0.025μg/kg。目前AFM1的检测方法主要有薄层层析法(TLC)、荧光分光光度法、液相色谱-串联质谱法及包括酶联免疫分析、免疫层析、免疫传感器在内的免疫学检测方法，其中免疫层析法因快速、简便和经济在AFM1的筛查中表现出了较强的优势。TLC法虽然是牛奶中黄曲霉毒素M1测定的国标方法之一，但是样品处理繁琐，过程复杂，且提取和净化效果不够理想，双向展开增加了操作步骤和时间，对人和环境污染系数较大。而免疫学检测方法操作简单、灵敏可靠，可快速检测多种牛奶样品，是理想的检测方法。目前检测黄曲霉毒素M1的试纸条虽有各种方法的报道，如中国专利CN110187118A、CN109752553A、CN108254560A的酶联免疫试剂盒、CN104897863A、CN107656060A、CN107561273A的荧光微球试纸条、CN107688016A的化学发光检测试剂盒以及CN202794185U、CN204556639U的胶体金试纸条，但酶联免疫试剂盒检测时间较长，不适合现场及时检测；利用传统有机荧光染料的荧光微球作为探针，传统有机荧光染料发光寿命较短，稳定性欠佳，容易出现光漂白现象，灵敏度相对较低；采用胶体金作为识别探针，胶体金颗粒粒径均一性较差，免疫标记物不稳定，只能进行定性检测，无法快速检测乳及乳制品中的AFM1的含量。目前，仍缺少检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光微球试纸条。哺乳类动物摄入被AFB1污染的饲料后，通过羟基化作用转化成AFM1，被AFM1污染的原料奶威胁着整个乳品产业链的安全。奶牛采食由霉菌毒素污染的饲料后，可在牛奶中检测到相应的霉菌毒素及其代谢物。AFM1和AFB1的广泛分布，更加大了乳及乳制品污染的风险。近年来，随着我国乳品消耗量的逐年升高，人们愈发重视乳品质量，建立一种更加灵敏快速并大通量地检测乳品中AFM1的方法已成为当务之急。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用时间分辨荧光探针快速灵敏检测黄曲霉毒素M1的免疫层析试纸条。本专利技术采用荧光微球替代传统胶体金，用荧光微球标记黄曲霉毒素M1抗体复合物，利用竞争免疫法，将其作为荧光探针用于免疫层析，通过读取荧光免疫分析仪上检测线的荧光值，可以对牛奶样品中的黄曲霉毒素M1进行快速定量分析。本专利技术第一个目的是提供一种检测黄曲霉毒素M1的时间分辨免疫层析定量试纸条，所述试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜(NC膜)和吸水纸，所述硝酸纤维素膜上设有检测线(T线)和质控线(C线)，所述检测线上包被黄曲霉毒素M1完全抗原(AFM1-OVA)，所述质控线包被羊抗鼠二抗。在本专利技术的一种实施方式中，所述黄曲霉毒素M1的检测浓度为0.05-2ng/mL。在本专利技术的一种实施方式中，所述黄曲霉毒素M1完全抗原的用量为0.1-0.8mg/mL，所述羊抗鼠二抗完全抗原的用量为0.1-1mg/mL。在本专利技术的一种实施方式中，所述检测线和质控线两线之间相距4-6mm。在本专利技术的一种实施方式中，所述时间分辨免疫层析定量试纸条的宽度为3-5mm。在本专利技术的一种实施方式中，所述检测线是将0.1-0.8mg/mL黄曲霉毒素M1完全抗原喷涂到硝酸纤维素膜上，每厘米的硝酸纤维素膜上检测线宽度喷涂量为1-2μL。当硝酸纤维素膜宽度为0.4cm时，喷涂量为0.4-0.8μL。在本专利技术的一种实施方式中，所述质控线是将0.1-1mg/mL羊抗鼠二抗喷涂到硝酸纤维素膜上，每厘米的硝酸纤维素膜上质控线宽度喷涂量为1-2μL/cm。当硝酸纤维素膜宽度为0.4cm时，喷涂量为0.4-0.8μL。在本专利技术的一种实施方式中，将喷涂好的硝酸纤维素膜置于37℃真空干燥箱中烘干备用。在本专利技术的一种实施方式中，所述黄曲霉毒素M1完全抗原用0.01MpH7.4的磷酸缓冲液(PBS)稀释至终浓度为0.1mg/mL-0.8mg/mL。在本专利技术的一种实施方式中，所述羊抗鼠二抗用0.01MpH7.4的磷酸缓冲液稀释至终浓度0.1mg/mL-0.5mg/mL。在本专利技术的一种实施方式中，所述时间分辨免疫层析定量试纸条中，吸水纸、硝酸纤维素膜以及样品垫依次相邻，且相邻部位部分重叠区域的长度为2-4mm；所述吸水纸、样品垫与硝酸纤维素膜分别重叠的部分位于硝酸纤维素膜的上侧。本专利技术的第二个目的是提供一种检测黄曲霉毒素M1的方法，所述方法包括如下步骤：(1)将经Eu3+-荧光微球标记的黄曲霉毒素M1单克隆抗体Eu-AFM1-mAb与黄曲霉M1的标准品混匀，20-30℃孵育使其充分竞争反应，加入到上述时间分辨免疫层析定量试纸条中的样品垫上进行层析，然后利用HG-98免疫定量分析仪测定样品在检测线和质控线处相应的荧光强度值：T值和C值；设置阴性对照，即样品中不含有黄曲霉毒素M1，利用HG-98免疫定量分析仪测得荧光强度T0值；(2)取T/T0作为参数，与浓度的对数值建立线性模型，得到黄曲霉毒素M1相应的标准曲线；(3)重复步骤(1)层析待测样品，将步骤(1)中的标准品替换为待测样品，得到待测样品的荧光强度值，代入步骤(2)所得的标准曲线，即得待测样品中的黄曲霉毒素M1含量结果。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中孵育时间为10-15min。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)中标记用的Eu3+-荧光微球是纳米级的聚苯乙烯微球中包裹了成千上万个经过螯合后的Eu3+荧光，而且聚苯乙烯微球表面修饰有羧基化基团用以偶联蛋白，提高蛋白(抗原或抗体)的荧光标记效率，从而有效地提高分析的灵敏度。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)中Eu3+-荧光微球的粒径100-300nm，固含量1％-10％，所述百分比为质量百分比。在本专利技术的一种实施方式中，所述的Eu3+-荧光微球标记黄曲霉本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测黄曲霉毒素M1的时间分辨免疫层析定量试纸条，其特征在于，所述时间分辨免疫层析定量试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述检测线上包被黄曲霉毒素M1完全抗原，所述质控线上包被羊抗鼠二抗。/n
【技术特征摘要】
1.一种检测黄曲霉毒素M1的时间分辨免疫层析定量试纸条，其特征在于，所述时间分辨免疫层析定量试纸条包括样品垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述检测线上包被黄曲霉毒素M1完全抗原，所述质控线上包被羊抗鼠二抗。
2.如权利要求1所述的时间分辨免疫层析定量试纸条，其特征在于，所述黄曲霉毒素M1的检测浓度为0.05-2ng/mL。
3.如权利要求1或2所述的时间分辨免疫层析定量试纸条，其特征在于，所述黄曲霉毒素M1完全抗原的用量为0.1-0.8mg/mL，所述羊抗鼠二抗完全抗原的用量为0.1-1mg/mL。
4.如权利要求1所述的时间分辨免疫层析定量试纸条，其特征在于，所述检测线和质控线两线之间相距4-6mm；所述试纸条的宽度为3-5mm。
5.一种检测黄曲霉毒素M1含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将经Eu3+-荧光微球标记的黄曲霉毒素M1单克隆抗体Eu-AFM1-mAb与黄曲霉毒素M1的标准品混匀，20-30℃孵育使其充分竞争反应，加入到权利要求1-4任一所述时间分辨免疫层析定量试纸条中的样品垫上进行层析，然后测定标准品在检测线和质控线处相应的荧光强度值，分别得到T值和C值；设置阴性对照，即样品中不含有黄曲霉毒素M1，测得荧光强度T0值；
(2)取T/T0作为参数，与浓度的对数值建立线性模型，得到黄曲霉毒素...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙秀兰，李淼，孙嘉笛，王海鸣，纪剑，张银志，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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