一种LAMP氢离子驱动i-motif变换比率型电化学传感器及构建方法技术

本发明专利技术涉及一种LAMP氢离子驱动i‑motif变换比率型电化学传感器及构建方法，通过常规LAMP技术与电化学检测相结合，利用目标物短链DNA延伸形成的双哑铃状结构中间体进行LAMP扩增，其副产物H

A ratio electrochemical sensor driven by lamp hydrogen ion and its construction method

【技术实现步骤摘要】
一种LAMP氢离子驱动i-motif变换比率型电化学传感器及构建方法
本专利技术属于生物传感器
，涉及一种LAMP氢离子驱动i-motif变换比率型电化学传感器及构建方法。
技术介绍
近年来，一些遗传学疾病、恶性肿瘤等已严重威胁着人类生命健康，给社会造成了严重的经济负担。其中，艾滋病由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起。据世界卫生组织统计，2016年底全球约有3700万人感染HIV，而我国约占70万人。大量研究证实，HIV感染人群并发感染其他病毒如人乳头瘤病毒的风险明显增加。因此，灵敏、快速、便捷、准确检测HIV特异性标志物(如DNA、RNA、蛋白质等)，对于其早期诊断、治疗、病情追踪等具有极其重要的现实意义和社会价值。环介导等温扩增(LAMP)是在闭管内于65℃45min～1h即可完成的一种强有力的核酸放大技术。其扩增机理是以长达150、甚至200个碱基以上的基因序列为目标物模板，在DNA聚合酶作用下，引物链末端的3'-OH对三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)的α-磷原子发起亲核进攻，3'-OH上的H被核苷酸碱基置换而释放H+和焦磷酸根离子，引物不断延伸而实现109放大倍率。因此，除长短不一的双链DNA主产物外，生成的大量H+(同时焦磷酸水解也产生H+)会引起LAMP反应溶液pH的改变(LAMP-H+)。LAMP技术具有高特异性，操作简便，快速高效，无需特殊昂贵仪器，已广泛用于细菌、病毒、生物酶活性、有机小分子、转基因食品的检测，以及临床疾病诊断和胚胎性别鉴定等。但也存在诸多不足，如扩增目标物模板过长、引物设计要求高、对单核苷酸多态性识别能力差、扩增产物难以准确定向控制等。常用的直接检测方法如凝胶电泳、浊度法、比色法和荧光法，以及间接的pH计测定，由于定量灵敏度低、稳定性差、操作不便等，极大限制了LAMP方法的实际应用能力。而通过改变LAMP反应装置，如与微流控或毛细管进行联用，设备复杂成本高、操作繁琐耗时、技术要求高；而在LAMP反应过程中引入生物连接酶或切割酶，或磁珠形成乳液微反应器，再经离心、磁分离、破乳、洗脱等步骤，不仅过程繁琐耗时，引入新的试剂还可能改变LAMP反应进程，加剧反应体系动力学过程的不确定性和复杂性，使得LAMP反应溶液更加多元，给后续定量检测带来更大的潜在干扰和假阳性信号，一定程度上会降低LAMP技术的特异性和灵敏度。近来，通过逆转录和连接反应，以仅有约20～30个碱基的目标miRNA通过链杂交反应形成双哑铃结构DNA引发LAMP反应，虽然极大简化了DNA模板和引物的设计，拓宽了LAMP的应用范围，但逆转录和连接反应使得LAMP扩增过程和产物组成复杂化。最近，将LAMP-H+诱导二聚体i-motif形成后，引入修饰电极表面启动酶支持的DNA行走放大，建立了测定流感病毒DNA电化学生物传感器。这为将LAMP放大与简便快捷、高灵敏、信号窗口宽的电化学分析相结合，并建立新型DNA电化学生物传感器提供了新思路和新途径。但目前尚无利用LAMP-H+转换信号的比率型电化学分析方法的相关报道。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种LAMP氢离子驱动i-motif变换比率型电化学传感器及构建方法。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、一种LAMP氢离子驱动i-motif变换比率型电化学传感器的构建方法，先将用不同电活性物质标记的两条单链DNA进行反应，然后将所得产物滴加至电极表面，最后在电极表面滴加LAMP反应溶液，即可完成所述传感器的构建；其中，LAMP反应溶液是通过以下方法制备得到的：利用hDNA与两条特殊的茎-环发夹DNA模板和前驱体进行扩增后，制备具有内引物结合位点的特殊双哑铃DNA结构，然后以该结构为起始模板，经LAMP扩增获得含大量副产物H+的LAMP反应溶液。hDNA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。hDNA：5’-ACTGCTAGAGATTTTCCACAT-3’，如SEQIDNO.1所示。优选的，所述的两条单链DNA(S1和S2)分别用二茂铁Fc和亚甲蓝MB标记，得Fc-S1和MB-S2，即为电化学信号探针。各核苷酸序列如下：S1：5’-SH-(CH2)6-AATGCAGTGGGAGGGGAAGGGAGGGGACTGCATT-3’，如SEQIDNO.6所示；S2：5’-CCCCTCCCTTCCCCTCCC-3’，如SEQIDNO.7所示。进一步优选的，Fc-S1和MB-S2的反应温度为室温(25℃)，反应时间为2小时，所得产物滴加至电极表面，孵育16小时。进一步优选的，所述Fc-S1分别在S1的5’端和3’用巯基(-SH)和Fc修饰，自由状态的构象为发夹结构，Fc-S1通过Au-S键结合到电极表面；所述MB-S2在S2的3’端修饰MB，其18个碱基富含14个C碱基，能形成具有pH响应的i-motif结构，且互补于Fc-S1的茎和环的18个碱基，能打开Fc-S1并与之杂交。优选的，所述内引物为BIP和FIP。进一步优选的，杂交反应条件为：PCR仪于50℃闭管反应20分钟。进一步优选的，所述HT为根据hDNA的碱基序列(含21个碱基)设计的含一茎-环发夹结构的DNA模板，其3’端用磷酸基团(PO43-)修饰，靠近3’端为hDNA的互补序列；所述HP为含一茎-环发夹结构的DNA前驱体，其3’端方向的21个碱基能与HT中靠近hDNA互补序列的21个碱基杂交；所述BIP的碱基序列为HT的一段B1C-B2；所述FIP的碱基序列为HP的一段F1C-F2。各核苷酸序列如下：DNA模板HT：5’-ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCACTTTCAGTCACGACGATTTTATGTCTGGTCTAGGGATTATG-3’，如SEQIDNO.2所示；DNA前驱体HP：5’-CGACAGCAGAGGATTTGTTGTGTGGAAGTGTGAGCGGATTTTCCTCTGCTGTCGTTTTCATAATCCCTAGACCAGACATCACACTTATGTGGAAAATCTCTAGCAGT-phosphate-3’，如SEQIDNO.3所示；内引物BIP：5’-ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCAC-3’，如SEQIDNO.4所示；内引物FIP：5’-CGACAGCAGAGGATTTGTTGTGTGGAAGTGTGAGCGGA-3’，如SEQIDNO.5所示。优选的，LAMP扩增的反应条件为：PCR仪中65℃闭管反应40分钟。优选的，具体步骤如下：(1)制备具有内引物BIP和FIP结合位点并能延伸的特殊双哑铃DNA结构；(2)加入内引物BIP和FIP，该双哑铃DNA结构为起始模板，进行快速、简便、高效的延伸和扩增，得到含大量副产物H+的LAMP反应溶液；(3)将两电化学信号探针Fc-S1和MB-S2在室温反应2小时后，滴加到电沉积金的玻碳电极表面；(4)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种LAMP氢离子驱动i-motif变换比率型电化学传感器的构建方法，其特征在于，先将用不同电活性物质标记的两条DNA单链进行反应，然后将所得产物滴加至电极表面，最后在电极表面滴加LAMP反应溶液，即可完成所述传感器的构建；其中，LAMP反应溶液是通过以下方法制备得到的：利用hDNA与两条特殊的茎-环发夹DNA模板和前驱体进行扩增后，制备具有内引物结合位点的特殊双哑铃DNA结构，然后以该结构为起始模板，经LAMP扩增获得含大量副产物H

【技术特征摘要】
1.一种LAMP氢离子驱动i-motif变换比率型电化学传感器的构建方法，其特征在于，先将用不同电活性物质标记的两条DNA单链进行反应，然后将所得产物滴加至电极表面，最后在电极表面滴加LAMP反应溶液，即可完成所述传感器的构建；其中，LAMP反应溶液是通过以下方法制备得到的：利用hDNA与两条特殊的茎-环发夹DNA模板和前驱体进行扩增后，制备具有内引物结合位点的特殊双哑铃DNA结构，然后以该结构为起始模板，经LAMP扩增获得含大量副产物H+的LAMP反应溶液。


2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的两条DNA单链为S1和S2，它们分别用二茂铁Fc和亚甲蓝MB标记，得Fc-S1和MB-S2，即为电化学信号探针。


3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，Fc-S1和MB-S2的反应温度为室温，反应时间为2小时，所得产物滴加至电极表面并孵育16小时。


4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述内引物为BIP和FIP。


5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，LAMP扩增的反应条件为：在PCR仪中于65℃闭管反应40分钟。


6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，具体步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：许文菊，滑笑雨，廖羽梦，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50