一种PD-L1抗体制造技术

本发明专利技术提供了一种新的抗PD‑L1单克隆重组单域抗体，属于肿瘤免疫治疗药物领域。本发明专利技术的PD‑L1抗体的序列如SEQ ID NO.1所示，其序列短，对PD‑L1结合能力强。本发明专利技术的PD‑L1理论上能用于肿瘤免疫治疗药物的制备，具备良好的应用前景。

A PD-L1 antibody

【技术实现步骤摘要】
一种PD-L1抗体
本专利技术属于肿瘤免疫治疗药物领域，尤其涉及一种抗PD-L1单克隆重组单域抗体。
技术介绍
肿瘤是二十一世纪危害人类健康的重大疾病之一。虽然目前治疗肿瘤已经有手术治疗、放疗、化疗、靶向治疗等治疗手段，但晚期肺癌患者五年生存率仅为5％，近年来，随着肿瘤免疫治疗药物的发展，免疫疗法已经成为一种新的更有前景的治疗手段，被公认为二十一世纪肿瘤治疗模式中的第4大支柱。目前在免疫疗法中，免疫检查点抑制剂和以嵌合抗原受体T细胞(ChimericantigenreceptorTcell，CAR-T)和T细胞受体T细胞(TcellreceptorTcell，TCR-T)为代表的细胞免疫治疗已经取得较好的临床疗效。免疫检查点(Immunecheckpoints)是在免疫反应中起到抑制免疫细胞过度激活作用的蛋白分子及信号通路；而免疫检查点抑制剂就是能够抑制免疫检查点发挥作用的分子，可通过增强T淋巴细胞的功能进而促进机体抗肿瘤免疫，杀伤肿瘤细胞。程序性死亡-1分子(programmeddeath-1，PD-1)就是一个十分著名的免疫检查点分子，表达于活化的T细胞表面。程序性死亡受体-配体1(programmedcelldeath-Ligand1，PD-L1)是PD-1的配体，它与PD-1结合就会促进后者发挥免疫抑制的作用，启动抗原特异性T细胞凋亡、减少调节性T细胞的凋亡。PD-L1在自体细胞表面表达，它的存在就是为了避免自身细胞被免疫细胞随意清除。而多种肿瘤(例如肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌等恶性肿瘤等)细胞表面也表达PD-L1，可以使肿瘤细胞免受免疫系统清除。PD-L1抗体是肿瘤免疫疗法中的一类药物，它通过结合PD-L1，阻断PD-1与PD-L1的结合，来减少免疫抑制作用，使T细胞发挥抗癌作用。基于类似的原理，PD-L1也可用于抗感染药物的制备，尤其是针对当前没有有效疫苗的病原体(比如HIV、肝炎病毒(甲、乙、丙)、流感病毒、疱疹病毒、贾第虫、疟疾、利什曼原虫、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等)的抗感染药物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的抗PD-L1单克隆重组单域抗体。本专利技术的技术方案如下：一种抗PD-L1单克隆重组单域抗体，其CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示，CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。如前述的抗PD-L1单克隆重组单域抗体，它具有如SEQIDNO.10所示的氨基酸序列。一种抗肿瘤生物免疫药物，它是以前述的PD-L1抗体为活性成分，加上药学上可接受的辅助性成分和/或载体制备而成的药物制剂。前述的重组单域抗体在制备PD-L1抑制剂中的用途。如前述的用途，所述PD-L1抑制剂是抑制PD-L1与PD-1结合的药物。如前所述的重组单域抗体在制备抗肿瘤药物中的用途。进一步地，所述肿瘤是恶性肿瘤。更进一步地，所述恶性肿瘤为肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、鼻咽癌、食管癌、宫颈癌、乳腺癌或胃癌。本专利技术具有如下有益效果：本专利技术提供了一种全新的抗PD-L1单克隆重组单域抗体，其仅具有368个氨基酸，分子量小，易于产业生产。本专利技术的PD-L1抗体能够充分结合肿瘤细胞表面的PD-L1，阻断PD-L1与PD-1的结合，其阻断效果与阳性对照Tecentriq(一种抗PD-L1的抗体)生物类似药相当。本专利技术的PD-L1抗体可以用于制备抗肿瘤免疫细胞药物，应用前景良好。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过具体实施方式对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1SEC-HPLC图图2是RNA电泳图。M：DNAmarker；泳道1：NB034；泳道2：NB035。图3是菌落PCR鉴定图。上方：NB034；下方：NB035；左侧第一泳道均为DNAmarker，marker大小同图2。图4是PD-1/PD-L1Bioassay荧光信号统计图。具体实施方式实施例1本专利技术PD-L1抗体B132205的制备PD-L1单克隆重组单域抗体制备的主要步骤如下：1、文库构建，获得免疫抗体蛋白为保证免疫结果可靠，免疫两只羊驼(编号：NB034和NB035)，经过4次免疫后，采集50mL外周血，分离PBMC(外周血单个核细胞)。然后用TRIzol试剂提取PBMC总RNA。取1μgRNA电泳，检测RNA纯度，结果表明RNA纯度良好(图1)。参见IIIFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR说明书将提取的RNA反转录为cDNA。用巢式PCR扩增编码重链抗体的可变区的核酸片段：第一轮PCR：上游引物F1：下游引物R1：第二轮PCR：以第一轮PCR产物作模板，上游引物F2：下游引物R2：下游引物R3：使用引物F1和R1进行第一轮PCR扩增，得到大小约为750bp的产物，纯化，使用引物F2和R2、R3(R2与R3混在一起，因为抗体有2个亚型，所以用到了2个反向引物)进行第二轮PCR扩增，得到大小约为450bp的VHH目的片段。将载体pocomb3Xss(NBbiolab，P001)与目的片段分别用SfiI进行酶切，50℃过夜酶切。酶切后，使用T4连接酶连接载体与目的片段，电泳，然后割胶回收目的片段。连接摩尔比例为pocomb3Xss：VHH＝1∶3。将前述连接产物随后电转化至E.coliTG1感受态细胞，构建针对PD-L1的重链单域抗体噬菌库展示文库并对文库进行鉴定。通过梯度稀释铺板，计算库容的大小为1.21×109。为检测文库的插入率，随机挑取48个克隆做菌落PCR，结果表明插入率均为100％(图2)。2、PD-L1重链单域抗体筛选将B132205抗体用PH值为9.6的碳酸盐缓冲液稀释至终浓度为5μg/mL，按100μL/孔加入酶标孔中，4℃包被过夜。弃包被液，每孔加入300μL3％BSA-PBS封闭液，37℃封闭1h后，加入100μL噬菌体文库，37℃孵育1h后，加入100μLGly-HCl洗脱液，将该洗脱液转移至1.5mL无菌离心管中，迅速用15μLTris-HCl中和缓冲液中和。取10μL进行梯度稀释，测定滴度，计算淘选回收率，其余洗脱物混合后进行扩增和纯化，用于下一轮亲和淘选，改变淘选条件，每一轮淘选条件如表1，共计三轮。表1亲和淘选条件将淘选洗脱物与处于对数生长前期的E.coliTG1培养物20mL混匀，37℃，静置30min。加入1mL20％葡萄糖，3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗PD-L1单克隆重组单域抗体，其特征在于，其CDR1的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗PD-L1单克隆重组单域抗体，其特征在于，其CDR1的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示，CDR2的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示，CDR3的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。


2.如权利要求1所述的抗PD-L1单克隆重组单域抗体，其特征在于，它具有如SEQIDNO.10所示的氨基酸序列。


3.一种抗肿瘤生物免疫药物，其特征在于，它是以权利要求1所述的PD-L1抗体为活性成分，加上药学上可接受的辅助性成分和/或载体制备而成的药物制剂。

【专利技术属性】
技术研发人员：卢铀，薛建新，仝瑞占，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：四川;51