一种对乙醇诱导损伤肝细胞具有保护作用的乳铁蛋白修饰肽的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种对乙醇诱导损伤肝细胞具有保护作用的乳铁蛋白修饰肽的制备方法，（1）称取乳铁蛋白，配制乳铁蛋白溶液；（2）向乳铁蛋白溶液中添加胃蛋白酶进行水解；（3）加热灭活蛋白酶，终止水解，冷却，离心制得乳铁蛋白水解物溶液；（4）真空冷冻干燥乳铁蛋白水解物溶液；（5）配制乳铁蛋白水解物溶液；（6）向乳铁蛋白水解物溶液中添加酪氨酸；（7）向乳铁蛋白水解物溶液中添加胃蛋白酶进行水解；（8）加热灭活蛋白酶，终止水解，冷却，离心制得乳铁蛋白水解物的类蛋白反应修饰肽溶液；（9）真空冷冻干燥制得乳铁蛋白水解物的类蛋白反应修饰肽。该乳铁蛋白水解物酪氨酸修饰物，具有可食用性、安全性和易被人体吸收的优点。

Preparation and application of lactoferrin modified peptide with protective effect on ethanol induced hepatocyte injury

【技术实现步骤摘要】
一种对乙醇诱导损伤肝细胞具有保护作用的乳铁蛋白修饰肽的制备方法及应用
本专利技术涉及一种对乙醇诱导损伤肝细胞具有保护作用的乳铁蛋白修饰肽的制备方法及应用，属于生物活性肽的制备及保健食品
技术背景酒精性肝病是由于乙醇摄入过量从而给肝脏带来一定的损伤并且引起一系列并发症，是患者无能为力的一种疾病。据统计，目前全世界范围内的酒精性肝病的发病率占87%，其中，欧美地区的发病率高于亚洲。而我国的酒精性肝病的发病率是50%。目前，临床药物治疗主要采用己酮可可碱（PTX）、糖皮质激素、抗肿瘤坏死基因α-抗体、抗氧化剂和阿坎酸等。而这些可以有效的治疗但是长期服用易引起糖尿病和其它并发症。因此，十分有必要制备一种天然食物来源、无毒副作用、且对肝细胞生长有积极保护和促进作用的功能性食品或保健品。乳铁蛋白肽（LFcin）是乳铁蛋白经胃蛋白酶水解得到的一种生物活性明显增强的多肽。其中，牛乳铁蛋白肽（LFcinB）是牛乳铁蛋白经过胃蛋白酶水解从N-端释放的含有25个氨基酸残基的多肽。LFcinB最早被分离出来，后来人们从不同物种中得到了不同来源的乳铁蛋白肽，如人、猪、鼠等。不同来源的乳铁蛋白肽同源性较高，只是长度有所差异。蛋白质的结构决定了性质，牛乳铁蛋白肽的25个氨基酸在胃蛋白酶水解之前呈α-螺旋构象排列，在经过水解之后构象发生变化为一种以β-折叠为主的两亲性结构。亲水基团和疏水基团位于β-折叠的两侧，这种两亲结构使其更容易与细胞膜结合，从而揭示了乳铁蛋白经过水解后生物活性明显增强的原因。已有研究发现，LFcinB诱导人胃癌细胞凋亡是通过抑制胃癌细胞后期的自噬。另一研究发现不同浓度的LFcinB对人结肠癌Caco-2细胞的增殖抑制作用，作用时间越长作用效果越明显。LFcinB使神经母细胞瘤细胞线粒体膜电位发生变化，导致细胞线粒体形态发生不可逆的变化和膜泡的形成。LFcinB剪切并激活了caspase-6、caspase-7和caspase-9，诱导了细胞死亡。LFcinB也能够抑制肝素结合生长因子Bfgf和VEGF165与内皮细胞表面的受体互作用。这导致内皮细胞的增殖和迁移受到抑制，最终在C57BL/6小鼠体内血管生成降低。此外，Bfgf和VEGF165的刺激，LFcinB在体外抑制内皮细胞（HUVECs）的增殖和迁移。LFcinB对纤维肉瘤细胞、结肠癌C26细胞和黑色素瘤B16F10细胞在体外有明显的毒性作用，导致致瘤小鼠体内肿瘤面积减少。超微结构试验研究结果揭示癌细胞膜完整性遭到破坏，最终导致细胞溶解。给致瘤早期的小鼠灌喂LFcinB能导致肿瘤细胞出现大面积出血性坏死。可是，尚未见有对乙醇诱导损伤的肝细胞具有保护作用的乳铁蛋白水解肽的相关开发。因此，开发、制备一种对乙醇诱导损伤的肝细胞具有保护作用的乳铁蛋白肽，具有广阔的应用和市场前景。因此，开发、制备一种对乙醇诱导损伤的肝细胞具有保护作用的乳铁蛋白水解物的类蛋白反应修饰肽，具有广阔的应用和市场前景。
技术实现思路
本专利技术针对现有活性肽制备技术中缺乏对乙醇诱导损伤肝细胞具有保护作用的蛋白肽的制备方法的不足，提供一种对乙醇诱导损伤肝细胞具有保护作用的乳铁蛋白修饰肽的制备方法。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种制备对乙醇诱导损伤肝细胞具有保护作用的乳铁蛋白水解物的类蛋白反应修饰肽，其制备方法包含以下步骤：步骤一：称取乳铁蛋白，用去离子水配制成溶液；步骤二：向乳铁蛋白溶液中添加胃蛋白酶，酶水解乳铁蛋白，调节体系pH值，在37℃的温度下水解4-8h；步骤三：水解结束后，立即将水解溶液加热至80℃、15分钟，使蛋白酶灭酶、终止反应；冰水浴冷却后，离心、收集上清液，得到乳铁蛋白水解物溶液；步骤四：通过真空冷冻干燥处理乳铁蛋白水解物溶液，冻干，于-20℃保存；步骤五：配制一定浓度的乳铁蛋白水解物溶液；步骤六：添加一定量的酪氨酸；步骤七：添加胃蛋白酶进行水解反应，调节体系的pH，在37℃的温度下水解6-12h；步骤八：反应结束后，立即将溶液加热至80℃、15分钟，使蛋白酶灭酶，乳铁蛋白水解物的类蛋白反应修饰肽通过真空冷冻干燥，冻干，于-20℃保存，得到对乙醇诱导损伤的肝细胞具有保护作用的乳铁蛋白水解物的类蛋白反应修饰肽。优选地，步骤一中乳铁蛋白溶液的质量浓度为5%（w/w）。优选地，步骤二中添加胃蛋白酶来水解乳铁蛋白，所述胃蛋白酶的添加量为0.75千活力单位/克蛋白质，调节体系pH值在2.5-3.0之间，水解4-8小时。优选地，步骤三中离心处理收集上清液的转速为12,000×g，离心时间为20分钟。优选地，步骤四中所述的真空冷冻干燥过程中，控制真空度为0.01毫帕至0.5毫帕,干燥时间为24小时至48小时,冷阱温度为-72℃至-45℃。优选地，步骤五中乳铁蛋白水解物溶液的浓度为40%（w/w）。优选地，步骤六中添加酪氨酸按照游离氨基含量与总游离氨基比为0.74mol/mol进行添加。优选地，步骤七中添加胃蛋白酶按照胃蛋白酶活力与底物浓度比为2.0千活力单位/克蛋白质进行添加，调节体系的pH为5.0，水解时间为6-12小时。优选地，步骤八中所述的真空冷冻干燥过程中，控制真空度为0.01毫帕至0.5毫帕,干燥时间为24小时至48小时，冷阱温度为-72℃至-45℃。本专利技术获得的乳铁蛋白水解物的类蛋白反应修饰肽的应用领域，是它可以作为功能性组分而应用于功能性食品或保健食品，从而保护肝细胞免于或降低乙醇诱导的损伤。本专利技术与现有的技术相比，具有的有益效果是：（1）本专利技术中所用的乳铁蛋白是常见的食品原料，具有可食用性与安全性，对人体无害，来源丰富。（2）本专利技术所涉及的乳铁蛋白水解物的类蛋白反应修饰肽，制备方法简单、安全、可大规模生产，且所产生的乳铁蛋白水解物的修饰肽比乳铁蛋白更容易被人体吸收。（3）本专利技术所涉及的乳铁蛋白水解物的类蛋白反应修饰物对肝细胞具有保护作用，为生产具有预防或治疗酒精性肝病效果的功能性食品或保健品提供新原料。附图说明图1是本专利技术的对乙醇诱导损伤肝细胞具有保护作用的乳铁蛋白修饰肽制备方法的流程图。具体实施方式下面通过附图和实施例对本专利技术的技术方案作进一步说明，但并不局限于此，凡对本专利技术技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，均应涵盖在本专利技术的保护范围中。实施例1本实施例记载的是一种对乙醇诱导损伤肝细胞具有保护作用的乳铁蛋白修饰肽的制备方法，所述的制备步骤包括：步骤一：称取乳铁蛋白，用去离子水配制成质量浓度为5%（w/w）的乳铁蛋白溶液；步骤二：向乳铁蛋白溶液中添加胃蛋白酶水解乳铁蛋白，胃蛋白酶添加量为0.75千活力单位/克，调节体系pH值为2.5-3.0，在37℃的温度下水解4小时；步骤三：水解结束后，立即将水解溶液加热至80℃、15分钟，使蛋白酶灭酶、终止反应；冰水浴冷却后，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对乙醇诱导损伤肝细胞具有保护作用的乳铁蛋白修饰肽的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包含以下步骤：/n步骤一：称取乳铁蛋白，用去离子水配制成溶液；/n步骤二：向乳铁蛋白溶液中添加胃蛋白酶，调节体系pH值，在37℃的温度下水解4-8小时；/n步骤三：水解结束后，立即将水解溶液加热至80 ℃、 15 分钟，使蛋白酶灭酶、终止反应；冰水浴冷却后，离心、收集上清液，得到乳铁蛋白水解物溶液；/n步骤四：通过真空冷冻干燥处理乳铁蛋白水解物溶液，冻干，于 -20 ℃ 保存；/n步骤五：配制一定浓度的乳铁蛋白水解物溶液；/n步骤六：添加一定量的酪氨酸；/n步骤七：添加胃蛋白酶进行水解，调节体系的pH，在37 ℃ 的温度下水解 6-12 h；/n步骤八：反应结束后，立即将溶液加热至80 ℃、 15 分钟，使蛋白酶灭酶，乳铁蛋白水解物的类蛋白反应修饰产物通过真空冷冻干燥，冻干，于 -20 ℃ 保存，得到对酒精诱导损伤的肝细胞具有保护作用的乳铁蛋白水解物的类蛋白反应修饰肽。/n

【技术特征摘要】
1.一种对乙醇诱导损伤肝细胞具有保护作用的乳铁蛋白修饰肽的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包含以下步骤：
步骤一：称取乳铁蛋白，用去离子水配制成溶液；
步骤二：向乳铁蛋白溶液中添加胃蛋白酶，调节体系pH值，在37℃的温度下水解4-8小时；
步骤三：水解结束后，立即将水解溶液加热至80℃、15分钟，使蛋白酶灭酶、终止反应；冰水浴冷却后，离心、收集上清液，得到乳铁蛋白水解物溶液；
步骤四：通过真空冷冻干燥处理乳铁蛋白水解物溶液，冻干，于-20℃保存；
步骤五：配制一定浓度的乳铁蛋白水解物溶液；
步骤六：添加一定量的酪氨酸；
步骤七：添加胃蛋白酶进行水解，调节体系的pH，在37℃的温度下水解6-12h；
步骤八：反应结束后，立即将溶液加热至80℃、15分钟，使蛋白酶灭酶，乳铁蛋白水解物的类蛋白反应修饰产物通过真空冷冻干燥，冻干，于-20℃保存，得到对酒精诱导损伤的肝细胞具有保护作用的乳铁蛋白水解物的类蛋白反应修饰肽。


2.根据权利要求1所述的对乙醇诱导损伤肝细胞具有保护作用的乳铁蛋白修饰肽的制备方法，其特征在于：步骤一中乳铁蛋白溶液的质量浓度为5%（w/w）。


3.根据权利要求1所述的对乙醇诱导损伤肝细胞具有保护作用的乳铁蛋白修饰肽的制备方法，其特征在于：步骤二中添加胃蛋白酶水解乳铁蛋白，所述胃蛋白酶的添加量为0.75千活力单位/克蛋白质，调节体系pH值为2.5-3.0，水解时间为4-8小时。


4.根据权利要求1所述的对乙醇诱导损伤肝细胞具有保护作用的乳铁蛋白修饰肽的制备方法，其特征在于：步骤三中离心处理收集上清液的离心转速为12,000×g，得...

【专利技术属性】
技术研发人员：薄力影，宋春丽，谭科，张慧君，孙天颖，任健，
申请(专利权)人：齐齐哈尔大学，
类型：发明
国别省市：黑龙;23