一种提高植物基因替换效率的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高植物基因替换效率的方法。所述方法包括如下步骤：将esgRNA、Cas9切刻酶、筛选剂抗性蛋白、供体DNA导入目的植物中；esgRNA靶向DNA片段甲靶点序列；Cas9切刻酶与筛选剂抗性蛋白共表达；供体DNA依次包括DNA片段甲靶点序列、DNA片段乙和DNA片段甲靶点序列；DNA片段乙为将DNA片段甲经过一个或几个碱基突变后得到的DNA分子；在esgRNA引导下，Cas9切刻酶在目的植物基因组中的DNA片段甲靶点序列处和供体DNA中的DNA片段甲靶点序列处均产生单链DNA切刻，并通过目的植物体内的修复机制将目的植物基因组中的DNA片段甲替换为DNA片段乙，实现植物基因替换。

A method to improve the efficiency of gene replacement in plants

【技术实现步骤摘要】
一种提高植物基因替换效率的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种提高植物基因替换效率的方法。
技术介绍
长链DNA模板介导的基因精确替换在细胞中的概率非常低，但是在待替换位点附近引入DNA双链断裂(dsDNAbreak，DSB)能够明显的增加替换的概率。CRISPR-Cas9技术已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9protein-RNA复合物通过向导RNA(guideRNA)定位于靶点上，通过切割使DNA产生DSB，从而增加长链DNA模板介导的基因精确替换效率。在产生DSB后，生物体会本能的启动DNA修复机制。修复机制一般有两种，一种是非同源末端连接(non-homologousendjoining，NHEJ)，此种修复所占的比例占大多数，修复DNA后一般会产生随机的indels(insertionsordeletions)。另一种是同源重组(homology-directedrepair，HDR)，使用姐妹染色单体或外源DNA供体(donor)作为修复模板，实现基因的精确修复。在动物细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种不产生DNA双链断裂的实现植物基因替换的方法，包括如下步骤：将esgRNA、Cas9切刻酶或其变体、筛选剂抗性蛋白、供体DNA导入目的植物中；/n所述esgRNA靶向DNA片段甲靶点序列；/n所述Cas9切刻酶或其变体与所述筛选剂抗性蛋白通过依次由启动子、所述Cas9切刻酶或其变体的编码基因、自切割寡肽的编码基因、所述筛选剂抗性蛋白的编码基因和终止子组成的表达盒或通过依次由启动子、所述筛选剂抗性蛋白的编码基因、自切割寡肽的编码基因、所述Cas9切刻酶或其变体的编码基因和终止子组成的表达盒导入目的植物中；/n所述供体DNA依次包括所述DNA片段甲靶点序列、DNA片段乙、所述DNA片段甲靶...

【技术特征摘要】
1.一种不产生DNA双链断裂的实现植物基因替换的方法，包括如下步骤：将esgRNA、Cas9切刻酶或其变体、筛选剂抗性蛋白、供体DNA导入目的植物中；
所述esgRNA靶向DNA片段甲靶点序列；
所述Cas9切刻酶或其变体与所述筛选剂抗性蛋白通过依次由启动子、所述Cas9切刻酶或其变体的编码基因、自切割寡肽的编码基因、所述筛选剂抗性蛋白的编码基因和终止子组成的表达盒或通过依次由启动子、所述筛选剂抗性蛋白的编码基因、自切割寡肽的编码基因、所述Cas9切刻酶或其变体的编码基因和终止子组成的表达盒导入目的植物中；
所述供体DNA依次包括所述DNA片段甲靶点序列、DNA片段乙、所述DNA片段甲靶点序列；
所述DNA片段乙为将所述DNA片段甲经过一个或几个碱基突变后得到的DNA分子；
在所述esgRNA引导下，所述Cas9切刻酶或其变体在目的植物基因组中的DNA片段甲靶点序列处和所述供体DNA中的DNA片段甲靶点序列处均产生单链DNA切刻，并通过目的植物体内的修复机制将目的植物基因组中的所述DNA片段甲替换为所述DNA片段乙，实现植物基因替换。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述DNA片段甲和所述DNA片段乙的大小均为200-2000bp；
和/或，所述DNA片段甲为序列5第1300-1993位所示的DNA分子；
和/或，所述DNA片段乙为序列1第10695-11388位所示的DNA分子。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述esgRNA结构如下：tRNA-所述DNA片段甲靶点序列转录的RNA-esgRNA骨架；
所述tRNA为a1)或a2)或a3)：
a1)将序列1第474-550位中的T替换为U得到的RNA分子；
a2)将a1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；
a3)与a1)或a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子；
所述esgRNA骨架为b1)或b2)或b3)：
b1)将序列7中的T替换为U得到的RNA分子；
b2)将b1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；
b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子。


4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：
所述Cas9切刻酶为Cas9D10A切刻酶或Cas9H840A切刻酶；
和/或，所述Cas9D10A切刻酶为SpCas9n蛋白质；
和/或，所述SpCas9n蛋白质为C1)或C2)：
C1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
C2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
和/或，所述SpCas9n蛋白质的编码基因为c1)或c2)或c3)：
c1)序列表中序列1第2877-6977位所示的cDNA分子或DNA分子；
c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述SpCas9n的cDNA分子或DNA分子；
c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述SpCas9n的cDNA分子或DNA分子。


5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：
所述Cas9切刻酶或其变体带有核定位信号；
和/或，所述核定位信号为BPNLS、VirD2NLS或SV40NLS；
和/或，所述核定位信...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐雯，武莹，杨进孝，宋伟，杨永星，贺晓庆，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京;11