一种基于CRISPR Cpf1的枯草芽孢杆菌多基因编辑和表达调控系统技术方案

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR Cpf1的枯草芽孢杆菌多基因编辑和表达调控系统。本发明专利技术通过构建的Cpf1表达载体pHT‑XCR6和crRNA阵列表达载体pcrF11，可以一次性完成2个基因的完全敲除，6个基因的碱基修饰以及1个基因的敲入。载体pHT‑XCR6上包含NgAgo蛋白，用于促进recA介导的同源重组。同时构建了载体pLCg6‑dCpf1‑remA(用于将DNA酶失活的Cpf1突变体dCpf1和转录激活因子remA的融合蛋白在枯草芽孢杆菌基因组上的整合表达)和pcra3(用于crRNA阵列在枯草芽孢杆菌基因组上的整合表达)，可以用于同时对不同基因进行转录抑制和激活。本发明专利技术还建立一种经济高效的名为SOMACA(Synthetic Oligos Mediated Assembly of crRNA Array)的crRNA阵列组装方法，可通过合成短单链DNA(<60nt)将所需的crRNA阵列插入到载体pcrF11或pcra3上，用于引导Cpf1或dCpf1‑remA进行基因编辑和表达调控。

A multi gene editing and expression regulation system of Bacillus subtilis based on CRISPR cpf1

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPRCpf1的枯草芽孢杆菌多基因编辑和表达调控系统
本专利技术涉及一种基于CRISPRCpf1的枯草芽孢杆菌多基因编辑和表达调控系统，属于基因工程

技术介绍
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generallyregardedassafe”(GRAS)安全级别；除此之外，其还是革兰氏阳性模式微生物，也常被用于微生物机理的研究。为了防止噬菌体的入侵，微生物进化出了很多防御系统，而CRISPR-Cas(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsandCRISPR-associatedproteins)系统则是其中比较常见的一种获得性免疫系统。以目前研究最为广泛的酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的CRISPR/Cas9系统为例，其作用机制如下：当第一次受到新的噬菌体入侵时，其会将噬菌体基因组上的原间隔序列(postospacer)作为新的间隔序本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR/Cpf1的枯草芽孢杆菌多基因编辑和表达调控系统，其特征在于，包括质粒pHT-XCR6、质粒pcrF11、质粒pLCg6-dCpf1-remA或质粒pcra3；所述的质粒pHT-XCR6和质粒pcrF11用于基因编辑；所述的质粒pLCg6-dCpf1-remA和质粒pcra3用于表达调控。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cpf1的枯草芽孢杆菌多基因编辑和表达调控系统，其特征在于，包括质粒pHT-XCR6、质粒pcrF11、质粒pLCg6-dCpf1-remA或质粒pcra3；所述的质粒pHT-XCR6和质粒pcrF11用于基因编辑；所述的质粒pLCg6-dCpf1-remA和质粒pcra3用于表达调控。


2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cpf1的枯草芽孢杆菌多基因编辑和表达调控系统，其特征在于，所述的质粒pHT-XCR6为Cpf1表达载体，包含Cpf1基因和NgAgo蛋白的编码基因，所述的NgAgo蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。


3.根据权利要求2所述的一种基于CRISPR/Cpf1的枯草芽孢杆菌多基因编辑和表达调控系统，其特征在于，所述的NgAgo蛋白的编码基因通过启动子Pgrac100调控表达。


4.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cpf1的枯草芽孢杆菌多基因编辑和表达调控系统，其特征在于，所述的质粒pcrF11为crRNA阵列表达载体，包括crRNA阵列插入区和同源臂插入区；所述的crRNA阵列插入区设置在启动子下游，用于插入要表达的crRNA阵列；所述的同源臂插入区包含EcoRI，SalI，XbaI和PstI四个酶切位点，用于插入基因编辑中所需的同源臂。


5.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cpf1的枯草芽孢杆菌多基因编辑和表达调控系统，其特征在于，所述的质粒pLCg6-dCpf1-remA为dCpf1整合表达载体，包括枯草芽孢杆菌lacA基因同源臂、D...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，武耀康，堵国成，李江华，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32