三维宽视场和高分辨层析成像方法及装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种三维宽视场和高分辨层析成像方法及装置，其中，该方法包括：在数字微镜器件上分别加载结构图案和平面图案，通过光源照射数字微镜器件依次产生结构光和均匀光并中继到样品上，收集激发出的结构光照明图像和均匀光照明图像；结构光和均匀光照明图像经过反射分束器件后被分为多个子视场图像；将多个子视场图像进行拼接得到宽视场结构光照明图像和宽视场均匀光照明图像；利用结构光层析算法将拼接后的宽视场结构光照明图像和宽视场均匀光照明图像进行结合得到宽视场光学层析图像；对样品进行轴向扫描成像，并将所得的宽视场光学层析图像进行数据重建，得到高分辨、宽视场的三维层析图像。该方法可以用于生物动态过程的三维快速成像。

Three dimensional wide field of view and high resolution tomographic methods and devices

【技术实现步骤摘要】
三维宽视场和高分辨层析成像方法及装置
本专利技术涉及光学显微
，特别涉及一种三维宽视场和高分辨层析成像方法及装置。
技术介绍
当前，光学显微成像在生物医学研究、临床疾病诊断等领域有着广泛地应用。考虑到生物活体样本通常具有三维立体的结构，为了对生物动态过程进行深入研究，常常需要对其进行快速三维宽视场、高分辨层析成像。宽场荧光显微镜由于具有视场大、成像速度快等优点而被广泛应用。然而，传统的宽场荧光显微镜存在以下问题：1)传统宽场荧光显微镜的轴向非定域激发特性使得其不具有光学层析能力，无法对生物样本进行三维立体成像。为了解决这个问题，人们提出了激光扫描共聚焦显微、双光子荧光显微等技术，获得了轴向光学层析能力。但是由于上述成像技术依赖于扫描成像，显微系统结构复杂，成像速度慢，难以满足实际需求。2)根据瑞利判据，在衍射受限的情况下，显微镜的光学分辨率可以通过来计算，其中，λex代表发射荧光的波长，NA代表物镜的数值孔径。由式(1)可以看出，在发射波长确定的情况下，物镜的数值孔径越大，显微系统的光学分辨率越高。因此，宽场荧光显微镜常常配备高数值孔径的物镜以获取高的光学分辨率。然而，宽场荧光显微镜的最终分辨率不仅仅取决于物镜的光学分辨率，还取决于相机的采样频率。根据奈奎斯特采样定理，只有在采样频率大于等于信号最高频率的2倍时，采样之后的数字信号才能完整地保留原始信号中的信息。因此，只有在满足：(pixelsize为相机像素的尺寸，magnification为成像系统的光学放大率)的情况下，显微系统的最终分辨率才是衍射受限的。在发射光波长、物镜NA、相机像素尺寸确定的情况下，可以通过增大显微系统的光学放大率来满足(2)式。然而，根据相机的成像视场的计算公式：(pixelnumber为像素个数，pixelsize为像素尺寸，magnification为光学系统放大率)，增大显微系统的光学放大率会缩小相机视场。因此，在实际使用宽场显微镜的过程中，人们往往通过牺牲宽视场来满足奈奎斯特采样定理从而实现高分辨，或通过亚采样以牺牲高分辨为代价实现宽视场成像，高分辨和宽视场难以同时被满足。要发展三维宽视场、高分辨层析成像方法，首先要解决传统宽场荧光显微镜缺失轴向层析能力的问题。采用正弦周期结构光照明(StructureIlluminationMicroscopy，SIM)的方法可获取光学层析图像。在这种方法中，为了获取一幅光学层析图像，需要拍摄三幅结构条纹照明的图像，每幅图像之间的条纹间隔为三分之一个条纹周期。然而，样本的移动对这种方法干扰很大。为了解决这个问题，可采用“HiLo”的结构光层析方法。在这种方法中，获取一幅层析图像只需要拍摄两幅图像，其中一幅是结构光照明的图像，另外一幅是均匀光照明的图像，将两幅图像结合起来可以计算恢复出层析图像。对于三维成像，常规方法需要通过轴向移动物镜或生物样本来实现。受到机械元件固有惯性的限制，上述方法的成像速度慢，难以用于实时观察三维生物动态过程。此外，如何突破宽视场与高分辨的矛盾，在满足奈奎斯特采样定理的条件下，同时获取宽视场图像，也是亟需解决的难题。传统的荧光显微镜由于受到相机像素数的限制，在满足奈奎斯特采样定理的情况下，成像尺度往往会受到限制。综上，如何实现三维宽视场、高分辨层析成像是显微成像领域亟需克服的技术难点。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种三维宽视场和高分辨层析成像方法，该方法实现宽视场、高分辨的三维层析成像，可以显著提高成像速度、扩大成像视场及简化装置节省成本，并可以用于生物动态过程的三维快速成像，具有广阔的生物医学应用前景。本专利技术的另一个目的在于提出一种三维宽视场和高分辨层析成像装置。为达到上述目的，本专利技术一方面实施例提出了一种三维宽视场和高分辨层析成像方法，包括：S1，在数字微镜器件上分别加载结构图案和平面图案，利用光源照射加载图案后的所述数字微镜器件分别产生结构光和均匀光；S2，利用管透镜、电调谐透镜和显微物镜分别将结构光和均匀光中继到样品上，并依次收集由结构光和均匀光所激发的结构光照明图像和均匀光照明图像；S3，所述结构光照明图像和所述均匀光照明图像分别经过所述显微物镜、透镜后在反射分束器上形成中间像面，并通过所述反射分束器上的多块不同偏转角度的平面反射镜进行多视场反射，利用相机采集多个反射光路上的子视场图像；S4，将多个子视场图像进行拼接的得到宽视场结构光照明图像和宽视场均匀光照明图像；S5，利用结构光层析算法将拼接后的所述宽视场结构光照明图像和所述宽视场均匀光照明图像进行结合得到宽视场光学层析图像；S6，通过所述电调谐透镜对所述样品进行轴向扫描成像，并将所得的不同轴向位置的所述宽视场光学层析图像进行数据重建，得到高分辨和宽视场的三维层析图像。本专利技术实施例的三维宽视场和高分辨层析成像方法，利用数字微镜器件产生结构光和均匀光对样品进行激发并收集荧光信号；收集光路引入的反射分束器件将中间像面的视场分为多个子视场，不同子视场的光束被反射分束器件以不同的角度反射到对应的收集装置中进行收集；将收集得到的子视场图像拼接成宽视场、高分辨的图像；拼接后的宽视场、高分辨结构光图像及其均匀光图像通过结构光层析算法组合计算出宽视场、高分辨的光学层析图像；通过电调谐透镜对样品进行轴向扫描，最终获取宽视场、高分辨的三维层析图像。该方法可同时获取宽视场、高分辨的三维图像，具有广阔的应用前景。另外，根据本专利技术上述实施例的三维宽视场和高分辨层析成像方法还可以具有以下附加的技术特征：进一步地，在本专利技术的一个实施例中，在步骤S1之前还包括：对所述样品的参数进行设定，设定沿所述样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴。进一步地，在本专利技术的一个实施例中，步骤S5进一步包括：S51，对所述宽视场均匀光照明的图像施加一个高通滤波器HP来获取焦平面内的高频信息S52，提取所述宽视场结构光照明图像的对比度：其中，σ表示求取图像方差；S53，通过对结构光对比度调制后的均匀图像施加一个低通滤波器LP来获取焦平面内的低频信息：S54，通过对获取的高频信息和低频信息进行组合来获取宽视场光学层析图像：其中，η为保证低频信息与高频信息强度连续的因子。进一步地，在本专利技术的一个实施例中，所述S3进一步包括：激发出的所述结构光照明图像和所述均匀光照明图像经过所述显微物镜和收集透镜后成像到所述反射分束器上形成中间像面，所述反射分束器由多块不同偏转角度的平面反射镜构成，通过所述显微物镜收集到的宽视场图像被所述反射分束器分成不同的子视场，各个子视场以不同的角度反射到对应的收集光路中被对应的相机所采集。为达到上述目的，本专利技术另一方面实施例提出了一种三维宽视场和高分辨层析成像装置，包括：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三维宽视场和高分辨层析成像方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1，在数字微镜器件上分别加载结构图案和平面图案，利用光源照射加载图案后的所述数字微镜器件分别产生结构光和均匀光；/nS2，利用管透镜、电调谐透镜和显微物镜分别将结构光和均匀光中继到样品上，并依次收集由结构光和均匀光所激发的结构光照明图像和均匀光照明图像；/nS3，所述结构光照明图像和所述均匀光照明图像分别经过所述显微物镜、透镜后在反射分束器上形成中间像面，并通过所述反射分束器上的多块不同偏转角度的平面反射镜进行多视场反射，利用相机采集多个反射光路上的子视场图像；/nS4，将多个子视场图像进行拼接的得到宽视场结构光照明图像和宽视场均匀光照明图像；/nS5，利用结构光层析算法将拼接后的所述宽视场结构光照明图像和所述宽视场均匀光照明图像进行结合得到宽视场光学层析图像；/nS6，通过所述电调谐透镜对所述样品进行轴向扫描成像，并将所得的不同轴向位置的所述宽视场光学层析图像进行数据重建，得到高分辨和宽视场的三维层析图像。/n

【技术特征摘要】
1.一种三维宽视场和高分辨层析成像方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，在数字微镜器件上分别加载结构图案和平面图案，利用光源照射加载图案后的所述数字微镜器件分别产生结构光和均匀光；
S2，利用管透镜、电调谐透镜和显微物镜分别将结构光和均匀光中继到样品上，并依次收集由结构光和均匀光所激发的结构光照明图像和均匀光照明图像；
S3，所述结构光照明图像和所述均匀光照明图像分别经过所述显微物镜、透镜后在反射分束器上形成中间像面，并通过所述反射分束器上的多块不同偏转角度的平面反射镜进行多视场反射，利用相机采集多个反射光路上的子视场图像；
S4，将多个子视场图像进行拼接的得到宽视场结构光照明图像和宽视场均匀光照明图像；
S5，利用结构光层析算法将拼接后的所述宽视场结构光照明图像和所述宽视场均匀光照明图像进行结合得到宽视场光学层析图像；
S6，通过所述电调谐透镜对所述样品进行轴向扫描成像，并将所得的不同轴向位置的所述宽视场光学层析图像进行数据重建，得到高分辨和宽视场的三维层析图像。


2.根据权利要求1所述的一种三维宽视场和高分辨层析成像方法，其特征在于，在步骤S1之前还包括：
对所述样品的参数进行设定，设定沿所述样品横向、纵向和轴向分别为x轴、y轴和z轴。


3.根据权利要求1所述的一种三维宽视场和高分辨层析成像方法，其特征在于，步骤S5进一步包括：
S51，对所述宽视场均匀光照明的图像施加一个高通滤波器HP来获取焦平面内的高频信息



S52，提取所述宽视场结构光照明图像的对比度：



其中，σ表示求取图像方差；
S53，通过对结构光对比度调制后的均匀图像施加一个低通滤波器LP来获取焦平面内的低频信息：



S54，通过对获取的高频信息和低频信息进行组合来获取宽视场光学层析图像：



其中，η为保证低频信息与高频信息强度连续的因子。


4.根据权利要求1所述的一种三维宽视场和高分辨层析成像方法，其特征在于，所述S3进一步包括：
激发出的所述结构光照明图像和所述均匀光照明图像经过所述显微物镜和收集透镜后成像到所述反射分束器上形成中间像面，所述反射分束器由多块不同偏转角度的平面反射镜构成，通过所述显微物镜收集到的宽视场图像被所述反射分束器分成不同的子视场，各个子视场以不同的角度反射到对应的收集光路中被对应的相机所采集。


5.一种三维宽视场和高分辨层析成像装置，其特征在于，包括：
结构光和均匀光产生系统，包括：光源(301)、激发光滤波片(302)、透镜(303)、透镜(304)、全内反射棱镜(305)和数字微镜器件(306)，用于产生结构光和均匀光；
光束整形和中继系统，包括：管透镜(307)、电调谐透镜(309)和显微物镜(310)，用于将所述结构光和均匀光产生系统所产生的结构光和均匀光中继到样品上；

【专利技术属性】
技术研发人员：孔令杰，施汝恒，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11