特发性肺纤维化疾病诊断标志物及其制备诊断或预后工具中的应用制造技术

本发明专利技术公开了特发性肺纤维化疾病诊断标志物及其制备诊断或预后工具中的应用。本发明专利技术涉及细胞色素C氧化酶亚基5B（COX5B）作为特发性纤维化（IPF）患者血清标志物的新发现。COX5B是线粒体内膜上呼吸链复合体III的组成成分之一，在IPF患者血清中COX5B含量升高，说明IPF患者线粒体损伤严重，COX5B释放到血清中，并且COX5B在IPF患者血清中含量与生存（Overall Survival）负相关，生存差的IPF患者血清中COX5B含量较高。本发明专利技术的研究成果为临床上进行特发性肺纤维化疾病的诊断提供了一种无创的方法，适于临床推广。

Diagnostic markers of idiopathic pulmonary fibrosis and their application in the preparation of diagnostic or prognostic tools

【技术实现步骤摘要】
特发性肺纤维化疾病诊断标志物及其制备诊断或预后工具中的应用
本专利技术属于医学诊断
，具体涉及一种特发性肺纤维化疾病诊断标志物及其制备诊断或预后工具中的应用。
技术介绍
特发性肺纤维化（IPF）是一种慢性进行性致死疾病，其病理学特点为肺实质破坏、肺泡上皮细胞表型显著变化、细胞外基质的沉积以及成纤维细胞异常增殖与积累。现在已知200多种原因可以引起特发性肺纤维化，如遗传性疾病、自身免疫性疾病、暴露于环境中有毒物质、药物和放射等。越来越多的证据表明，在肺纤维化的发生发展过程中，不仅广泛存在着个体间异质性（inter-heterogeneity）和个体内组织细胞的异质性（intra-heterogeneity），而且还广泛存在着个体在细胞和分子等各种层次的动态变化。当前对肺纤维化的发病机制研究发现与线粒体功能障碍密切相关。利用蛋白质组学的技术能更好地全面解析复杂疾病的机制、筛选疾病标志物、研究药物作用靶点、筛选特殊功能蛋白质等。已有的组学研究发现肺纤维化患者的血清中CCNA2、PBMC、CD28等的异常表达，蛋白质修饰主要体现在CDKN2B、CAR10、MGMT等的甲基化和CASZ1的超甲基化等，代谢组学结果表明腺苷三磷酸降解途径、糖酵解途径、谷胱甘肽生物合成途径和鸟氨酸转氨酶途径中均发生了明显的变化。据统计，全球每年约新增特发性肺纤维化患者500万人，预后较差，诊断后中位生存期为2-3年。特发性肺纤维化的病因不明确、诊断易混淆等特点，在临床上用于诊断特发性肺纤维化的手段往往缺乏特异性，迫切需要更高效、稳定的手段来预警或判断特发性肺纤维化。因此开发一种可用于准确诊断IPF的方法是亟待解决的问题。细胞色素C氧化酶（COX）是线粒体呼吸链的末端酶。它是一种多亚基酶复合物，可将电子从细胞色素C转移到分子氧上，并促进跨线粒体内膜的质子电化学梯度。该复合物由13个线粒体和核编码亚基组成。线粒体编码的亚基执行电子转移和质子泵活动。核编码亚基的功能可能在复合物的调控和组装中发挥作用。该基因（COX5B）编码人线粒体呼吸链酶的核编码亚基Vb。在功能正常的线粒体中，该蛋白位于线粒体内膜上，当线粒体受到损伤，线粒体膜电位去极化，内外膜损伤，位于线粒体内膜的呼吸链复合体III解体，COX5B蛋白释放到血清中。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种特发性肺纤维化疾病诊断标志物及其制备诊断或预后工具中的应用，通过LC-MS/MS质谱的DIA方法检测到COX5B在特发性肺纤维化患者的血液中的含量比正常人高。COX5B蛋白是线粒体内膜上呼吸链复合体III的组成成分之一，在特发性肺纤维化患者血清中COX5B蛋白水平较高，说明IPF患者线粒体损伤严重，COX5B蛋白释放到血清中，并且COX5B蛋白水平与IPF患者生存OS负相关，生存差的IPF患者血清中COX5B蛋白水平较高，可以进一步开发诊断特发性肺纤维化疾病的工具。本专利技术为实现上述目的采用如下技术方案，特发性肺纤维化疾病诊断标志物，其特征在于该诊断标志物为COX5B基因表达产物，COX5B基因的编码序列包括以下任一一种DNA序列：（1）序列表中SEQIDNO.2所示的DNA序列；（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；（3）与（1）或（2）限定的DNA序列具有70%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。优选的，所述COX5B基因表达产物包括COX5B蛋白、COX5B蛋白的功能等同物以及COX5B蛋白的部分肽，其中COX5B蛋白的部分肽含有与特发性肺纤维化相关的功能域；COX5B蛋白的功能等同物包括COX5B蛋白保守性变异蛋白质，或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与COX5B的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。优选的，所述COX5B蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：（1）由序列表中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（2）将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列衍生的蛋白质，取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个；（3）与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有至少80%同源性的氨基酸序列构成的多肽，又称为序列同一性的多肽。优选的，所述COX5B基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、肺组织、支气管肺泡灌洗样本或呼出气冷凝液或脊髓液。本专利技术所述特发性肺纤维化疾病诊断标志物在制备诊断或预后工具中的应用，其特征在于：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测COX5B基因的表达水平以诊断特发性肺纤维化疾病，在IPF患者血清中COX5B含量较高，说明IPF患者线粒体损伤严重，COX5B释放到血清中，并且COX5B含量与IPF患者生存OS负相关，生存差的IPF患者血清中COX5B含量较高。优选的，用RT-PCR诊断特发性肺纤维化的产品至少包括一对特异扩增COX5B基因的引物；用实时定量PCR诊断特发性肺纤维化的产品至少包括一对特异扩增COX5B基因的引物；用免疫检测诊断特发性肺纤维化的产品包括与COX5B基因表达产物特异性结合的抗体；用原位杂交诊断特发性肺纤维化的产品包括与COX5B基因的核酸序列杂交的探针；用芯片诊断特发性肺纤维化的产品包括蛋白芯片和基因芯片；其中蛋白芯片包括与COX5B蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与COX5B基因的核酸序列杂交的探针。优选的，用实时定量PCR诊断特发性肺纤维化的产品至少包括一对特异扩增COX5B基因的引物，该引物序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6、SEQIDNO.7和SEQIDNO.8、SEQIDNO.9和SEQIDNO.10及SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示。优选的，所述工具通过检测样本中COX5B基因的表达来诊断特发性肺纤维化，该工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。优选的，所述芯片包括基因芯片或蛋白质芯片，所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测COX5B基因转录水平的针对COX5B基因的寡核苷酸探针，所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的COX5B蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒或蛋白免疫检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测COX5B基因转录水平的试剂，所述蛋白免疫检测试剂盒包括COX5B蛋白的特异性抗体；所述试纸包括用于检测COX5B基因转录水平的试剂；所述高通量测序平台包括用于检测COX5B基因转录水平的试剂。优选的，所述检测COX5B基因转录水平的试剂包括针对COX5B基因的引物和/或探针。本专利技术涉及细胞色素C氧化酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.特发性肺纤维化疾病诊断标志物，其特征在于该诊断标志物为COX5B基因表达产物，COX5B基因的编码序列包括以下任一一种DNA序列：/n（1）序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA序列；/n（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；/n（3）与（1）或（2）限定的DNA序列具有70%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。/n

【技术特征摘要】
1.特发性肺纤维化疾病诊断标志物，其特征在于该诊断标志物为COX5B基因表达产物，COX5B基因的编码序列包括以下任一一种DNA序列：
（1）序列表中SEQIDNO.2所示的DNA序列；
（2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
（3）与（1）或（2）限定的DNA序列具有70%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。


2.根据权利要求1所述的特发性肺纤维化疾病诊断标志物，其特征在于：所述COX5B基因表达产物包括COX5B蛋白、COX5B蛋白的功能等同物以及COX5B蛋白的部分肽，其中COX5B蛋白的部分肽含有与特发性肺纤维化相关的功能域；COX5B蛋白的功能等同物包括COX5B蛋白保守性变异蛋白质，或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与COX5B的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。


3.根据权利要求2所述的特发性肺纤维化疾病诊断标志物，其特征在于：所述COX5B蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
（1）由序列表中SEQIDNO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
（2）将SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列衍生的蛋白质，取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个；
（3）与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有至少80%同源性的氨基酸序列构成的多肽，又称为序列同一性的多肽。


4.根据权利要求1所述的特发性肺纤维化疾病诊断标志物，其特征在于：所述COX5B基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、肺组织、支气管肺泡灌洗样本或呼出气冷凝液或脊髓液。


5.权利要求1-4中任意一项所述的特发性肺纤维化疾病诊断标志物在制备诊断或预后工具中的应用，其特征在于：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测COX5B基因的表达水平以诊断特发性肺纤维化疾病，在IPF患者血清中COX5B基因的表达水平较高，说明IPF患者线粒体损伤严重，CO...

【专利技术属性】
技术研发人员：王兰，余国营，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：河南;41