用于检测HLA-B*27等位基因的试剂盒、组合物及方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种用于检测HLA‑B*27等位基因的试剂盒、组合物及方法。所述的试剂盒包含用于检测HLA‑B*27等位基因的探针以及引物对，可以特异性检测HLA‑B*27等位基因，且灵敏度高，重复性好。

Kit, composition and method for detecting HLA-B * 27 allele

【技术实现步骤摘要】
用于检测HLA-B*27等位基因的试剂盒、组合物及方法
本专利技术涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种用于检测HLA-B*27等位基因的试剂盒、组合物及方法。
技术介绍
HLA-B*27是人类主要组织相容性复合体(MajorHistocompatibilityComplex，MHC)的表达产物，位于人类第6号染色体的短臂上。其在人类免疫系统中发挥着重要作用，参与免疫细胞之间的相互识别、抗原提呈、调节免疫应答等多种免疫学功能。根据HLA抗原的结构、功能与组织分布的不同，可分为三类：Ⅰ类分子包括HLA-A、-B、-C系列抗原，广泛分布于各组织有核细胞表面，包括血小板和网织红细胞；Ⅱ类分子为HLA-D/DR、-DP、DQ系列抗原，主要在表达于B细胞和抗原提呈细胞；Ⅲ类分子主要为补体成分。HLA-B*27属Ⅰ类抗原，具有高度多态性，其等位基因间的差异主要由编码蛋白质氨基酸的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)组成，其亚型分布呈区域和种族差异性，中国汉族主要以B*2704为主。强直性脊柱炎(Ankylosingspondylitis，AS)是一种以脊柱和骶髂关节及周围大关节附着炎症为主要临床表现的自身免疫性关节炎。AS可致患者出现永久性的关节功能丧失，病变甚至可累及心脏、肺部、眼部等器官，造成患者伤残并导致生活质量严重低下。目前，AS的早期诊断还依据1984年纽约修订的诊断标准[1]，该标准要求AS诊断需要有肯定的关节炎表现并结合影像学检查进行确诊。但AS起病隐匿，早期可无任何临床表现，当存在明确的临床表现时疾病往往已进展至中期，已经造成了不可逆的关节损伤。因此，基于早期诊断基础之上的干预治疗对减少AS的致残率及提高患者的生活质量有着十分重要的意义。早在1973年，人们就已发现HLA-B*27抗原的表达与AS具有高度相关性。据报道，在AS患者有超过90％的HLA-B*27抗原表达为阳性，普通人群中仅占5-10％。结合临床表现及影像学检查可极大地提高诊断AS的阳性预测值，降低误诊率，且HLA-B*27抗原阳性除了与AS有关外，还与其他如Reiter综合症、葡萄膜炎、溃疡性结肠炎等多种疾病发生相关，因此HLA-B*27抗原的检测在临床上具有很高的检验价值。现阶段，临床上常用的HLA-B*27检测方法有流式细胞术法(flowcytometry，FCM)、基于聚合酶链式反应(polyrneraseChainReaction，PCR)发展而来的PCR-单链构象多态性(PCR-single-strandconformationpolymorphism，PCR-SSCP)、PCR-直接碱基序列分析基因分型技术(PCR-sequencebasedgenotyping，PCR-SBT)等等，传统的微量淋巴细胞毒实验因分型错误率高在临床上已停止使用。FCM法采用HLA-B*27单克隆抗体直接结合免疫细胞HLA-B*27抗原，不仅能快速分离出淋巴细胞的亚群，还可计算HLA-B*27抗原阳性淋巴细胞的百分比，具有操作简便、特异性高、结果重复性好等优点，在临床上使用效果良好。但FCM也存在诸多局限，如对标本质量要求高；流式仪昂贵无法在基层医院普及；与HLA-B*07抗原存在交叉反应等诸多缺点，且FCM是基于HLA-B*27抗原蛋白表达的检测，与基因表达检测的结果并不一定总是一致[2]。多种文献显示基于基因表达检测的PCR法具有更高的敏感度。PCR法中，PCR-SBT检测最为准确，具有很高的灵敏度与特异度。但其检测条件要求高且检测周期长，测序的费用也较高；PCR-SSCP方法是一种经典的分析方法，但其需要通过电泳来检测，步骤繁琐、周期长、且存在潜在的污染环节多，临床上已较少使用；而基于SYBRgreen染料的荧光定量PCR法特异性不足且缺乏内控。[1]vanderLindenS；ValkenburgHA；CatsA.Evaluationofdiagnosticcriteriaforankylosingspondylitis.AproposalformodificationoftheNewYorkcriteria[J].ArthritisandRheumatism，1984，27(04):361-368.DOI:10.1002/art.1780270401.[2]滕凤猛，高峰，余清，etal.流式细胞仪检测HLA-B27的性能评价及其影响因素的探讨[J].国际检验医学杂志，2013(20):2752-2754.
技术实现思路
本专利技术针对现有的HLA-B*27等位基因检测技术存在的费用昂贵、周期长、特异度灵敏度不足等特点，提供了一种用于检测HLA-B*27等位基因的试剂盒、组合物及方法，本专利技术涉及一种试剂盒，其包含用于检测HLA-B*27等位基因的探针以及引物对；所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述引物对包括SEQIDNO：2所示的正向引物和SEQIDNO：3所示的反向引物。该试剂盒可以特异性检测HLA-B*27等位基因，且灵敏度高，重复性好。本专利技术所提供的技术方案适用范围广，在基层医院可替代FCM法，大大节约检测成本；敏感度高于FCM法，适合人群HLA-B*27基因的大范围筛查；同FCM法联合检验更可显著提高HLA-B*27的检测准确度，提高检验能力。本专利技术还提供组合物，其由如上所述的试剂盒中的物质与受试者基因组DNA混合得到。根据本专利技术的再一方面，本专利技术还涉及一种检测HLA-B*27等位基因的方法，所述方法是诊断或非诊断目的，其包括如下步骤：获取如上所述的组合物，并在合适的条件下进行PCR扩增反应。本方法操作简便，无需测序，成本低廉，迎合了临床具体工作情况和要求，方法快速，可以只需一步PCR反应，无需纯化和预处理可直接上机检测，通量高，结果清晰容易判断，在临床上极具推广价值。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术一个实施例中本专利技术所采用的阳性对照质粒的质粒图谱；图2为本专利技术一个实施例中所构建的阳性质粒标准品标准曲线；图3为本专利技术一个实施例中待检样品的扩增曲线。具体实施方式现将详细地提供本专利技术实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本专利技术。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本专利技术进行多种修改和变化而不背离本专利技术的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。因此，旨在本专利技术覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本专利技术的其它对象、特征和方面公开于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.试剂盒，其包含用于检测HLA-B*27等位基因的探针以及引物对；/n所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；/n所述引物对包括SEQ ID NO：2所示的正向引物和SEQ ID NO：3所示的反向引物。/n

【技术特征摘要】
1.试剂盒，其包含用于检测HLA-B*27等位基因的探针以及引物对；
所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；
所述引物对包括SEQIDNO：2所示的正向引物和SEQIDNO：3所示的反向引物。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其还包含用于检测看家基因的内标引物对和内标探针。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，所述看家基因为GAPDH。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，所述内标探针的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示，所述内标引物对包括SEQIDNO：5所示的正向引物和SEQIDNO：6所示的反向引物。


5.根据权利要求1～4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述探针和/或内标探针包含可检测的标记。


6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述探针和/或内标探针为荧光探针。


7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述探针和/或内标探针具有荧光报告基团，所述荧光报告基团独立...

【专利技术属性】
技术研发人员：林锦骠，汤纪丰，欧启水，林隽宇，
申请(专利权)人：福建医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：福建;35