一种从铁皮石斛中提取RNA的试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及一种从铁皮石斛中提取RNA的试剂盒，其包括以下溶液：溶液A：β‑巯基乙醇；溶液B：1～2g/L的Tris、1.5～2.5g/L的2％十六烷基三乙基溴化铵、8～9g/L NaCl、0.5～1g/L EDTA，pH为5.3～5.5；溶液C：18～22g/L乙酸钾；溶液D：乙醇；溶液E：氯仿；溶液F：异丙醇；溶液G：75％乙醇；溶液H：DEPC水。采用该试剂盒可以从铁皮石斛中分离得到RNA，提取得到的RNA不仅浓度高、纯度高，而且完整性也好，可用于高要求的生物学实验和高通量测序，并且操作简单，可大大缩短实验时间。本发明专利技术的试剂盒还适用于其它富含水溶性多糖、多酚、淀粉的植物材料的RNA提取。

A kit and method for RNA extraction from Dendrobium candidum

【技术实现步骤摘要】
一种从铁皮石斛中提取RNA的试剂盒及方法
本专利技术属于分子生物
，具体涉及一种从铁皮石斛中提取RNA的试剂盒及方法。
技术介绍
进行植物基因克隆、Northern杂交分析、cDNA文库构建、RT-PCR和RealtimePCR等分子生物学的研究时，通常需要得到完整的RNA。近年来兴起的高通量测序，对RNA的质量和浓度要求更高，RNA浓度要求大于200ng/ul，总量大于15ug。所以从植物中分离到纯度高且完整性好的RNA，是顺利进行上述实验研究的关键。铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)为兰科石斛属草本植物，因其茎节处呈黑褐色，又称黑节草，是我国传统珍贵药材之一，与人参、天山雪莲、灵芝等并称为中华九大仙草。现代研究表明，铁皮石斛具有抗肝损伤、增强免疫、促消化、抗疲劳、降血糖、促进唾液分泌、降血压等功效。铁皮石斛含石斛多糖、石斛碱、氨基酸、微量元素和菲类化合物等多种活性成分，其中多糖为其主要的活性成分，也是其中含量最高的物质。铁皮石斛组织中水溶性多糖含量较高，从中提取RNA非常困难，这是因为植物组织中水溶性多糖的理化性质与RNA相似，溶于水而不溶于无水乙醇、异丙醇等有机溶剂，因此很难将水溶性多糖和RNA分开。而多糖也可以抑制许多酶的活性，污染了的水溶性多糖的RNA样品就无法用于进一步的分子生物学研究。另外，富含多酚类的植物，在植物组织受到破坏后，就会释放出大量的酚类物质，酚被氧化而形成的褐色醌类物质能与RNA稳定结合；富含淀粉的植物，在提取RNA过程中淀粉也很难与RNA分离。因此，很难从富含水溶性多糖、多酚和淀粉的植物材料(如富含多糖的药用植物铁皮石斛、茯苓和黄精)中分离提取到高纯度、高浓度完整的RNA。目前常用的RNA提取方法有CTAB法、SDS法、天泽RNAOut2.0等。CTAB法操作步骤大致如下：将冷冻的植物组织，在低温干燥状态下机械磨碎(通常的做法是加液氮使材料变脆，易于研磨)，低温降低了DNase的活性，利于CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)去污剂溶解细胞膜，使核蛋白等解聚，使DNA游离出来，该方法存在RNA降解的问题，提取效率低；改良SDS法提取RNA主要用机械的方法使组织和细胞破碎，然后加入十二烷基磺酸钠(SDS)等离子型表面活性剂，使蛋白变性，最后加入无水乙醇沉淀DNA，沉淀的DNA，即为植物的总DNA，溶于TE溶液中保存备用，使用改良版SDS法对植物进行提取时，提取过程中溶液会粘稠成团，无法摇匀，无法进行下一步实验；使用一步法质粒RNAOut2.0(上海信裕生物科技有限公司柱式植物RNAout2.0)进行提取直接使用新鲜的或冷冻的抗凝全血样品，不需要裂解红细胞等任何预处理步骤，整个提取只需要10min左右，可以全在室温下进行，在水溶性多糖含量低于20％时可以提取到，但效率较低，只能满足一些常规实验，无法满足高通量测序的需求，当水溶性多糖含量更高时，水溶性多糖会与RNA缠绕在一起堵住滤膜，无法洗脱；使用低浓度乙醇处理、氯化铿沉淀法等来去除水溶性多糖，但都会使提取效率大大降低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决上述现有技术中的不足，提供一种从铁皮石斛中提取RNA的试剂盒及相应的提取方法，该方法能够从铁皮石斛中分离到纯度高且完整性好的RNA。技术方案一种从铁皮石斛中提取RNA的试剂盒，其包括如下组分：(1)溶液A：β-巯基乙醇；(2)溶液B：1～2g/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1.5～2.5g/L的2％十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)、8～9g/LNaCl、0.5～1g/LEDTA，硼酸调pH为5.3～5.5；(3)溶液C：18～22g/L乙酸钾；(4)溶液D：乙醇；(5)溶液E：氯仿；(6)溶液F：异丙醇；(7)溶液G：75v％乙醇；(8)溶液H：DEPC水。上述试剂盒的组分中，配制溶液(例如溶液B、溶液C等)所用的溶剂均为无RNA酶水，所述无RNA酶水的配制方法为：通过固相RNase清除剂原液按(0.8～1.2):1000比例加入蒸馏水，混匀后室温放置22～26h，即可使用。采用上述试剂盒从铁皮石斛中提取RNA的方法，包括以下步骤：(1)取铁皮石斛组培苗茎秆放入研钵中，加入液氮，研磨成粉末，得到铁皮石斛组织样品；(2)取0.1g铁皮石斛组织样品，加入0.8～1.2ml溶液B、18～22μL溶液A，置于50～58℃水浴18～22min后，加入80～120μL溶液C、80～120μL溶液D、550～650μL溶液E，涡旋0.5～3min，离心，取上清，往上清中加入0.8～1.2mLRNA提取试剂RNAzol，得到提取液；(3)往步骤(2)获得的提取液中加入180～220μL溶液E，振荡混匀后，室温放置10～20min，离心取上清，然后重复本步骤一次，得到上清液；(4)往步骤(3)获得的上清液中加入溶液F，混匀后室温放置10～30min，然后离心弃掉上清液；(5)往步骤(4)离心后得到的沉淀中加入0.8～1.2ml溶液G，以3000～5000r/min的转速振荡，悬浮沉淀，然后离心弃掉上清液，将得到的沉淀室温晾干5～10min，用25～35μL溶液H溶解，即为铁皮石斛RNA样品。进一步，步骤(2)-(5)中，离心条件为：3～5℃，10000～13000r/min。进一步，步骤(4)中，溶液F的用量体积为上清液体积的0.7～1倍。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种从铁皮石斛中提取RNA的试剂盒，试剂盒中所用成分为一般实验药品，对人体无害，对环境友好，利用其可以从铁皮石斛中分离得到RNA，与现有技术提取RNA的方法相比，本专利技术的提取方法提取得到的RNA不仅浓度高、纯度高，而且完整性也好，可用于高要求的生物学实验和高通量测序，并且方法步骤少，操作简单，可大大缩短实验时间而，缩短时间可有效防止RNA降解，减少操作步骤可最大限度减少在操作过程中的损失。本专利技术的试剂盒和提取方法还适用于其它富含水溶性多糖、多酚、淀粉的植物材料。附图说明图1为实施例1中的铁皮石斛生长60天的组培苗的电泳图；图2为实施例1中生长期90天的铁皮石斛组培苗的电泳图；图3为实施例1中生长期为150天的铁皮石斛组培苗电泳图；图4为实施例1、对比例1、对比例2中从生长期为150天的铁皮石斛组培苗茎秆提取的铁皮石斛RNA的OD260/OD280比值平均值；图5为实施例1、对比例1、对比例2中从生长期为150天的铁皮石斛组培苗茎秆提取的铁皮石斛RNA的OD260/OD230比值平均值。具体实施方式为了使本专利技术的专利技术目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合附图和实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅是为了解释本专利技术，并非为了限定本专利技术，实施例的配方、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例1...

【技术保护点】
1.一种从铁皮石斛中提取RNA的试剂盒，其特征在于，其包括如下组分：/n(1)溶液A：β-巯基乙醇；/n(2)溶液B：1～2g/L的三羟甲基氨基甲烷、1.5～2.5g/L的2％十六烷基三乙基溴化铵、8～9g/LNaCl、0.5～1g/L EDTA，硼酸调pH为5.3～5.5；/n(3)溶液C：18～22g/L乙酸钾；/n(4)溶液D：乙醇；/n(5)溶液E：氯仿；/n(6)溶液F：异丙醇；/n(7)溶液G：75％乙醇；/n(8)溶液H：DEPC水。/n

【技术特征摘要】
1.一种从铁皮石斛中提取RNA的试剂盒，其特征在于，其包括如下组分：
(1)溶液A：β-巯基乙醇；
(2)溶液B：1～2g/L的三羟甲基氨基甲烷、1.5～2.5g/L的2％十六烷基三乙基溴化铵、8～9g/LNaCl、0.5～1g/LEDTA，硼酸调pH为5.3～5.5；
(3)溶液C：18～22g/L乙酸钾；
(4)溶液D：乙醇；
(5)溶液E：氯仿；
(6)溶液F：异丙醇；
(7)溶液G：75％乙醇；
(8)溶液H：DEPC水。


2.采用权利要求1所述试剂盒从铁皮石斛中提取RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取铁皮石斛组培苗茎秆放入研钵中，加入液氮，研磨成粉末，得到铁皮石斛组织样品；
(2)取0.1g铁皮石斛组织样品，加入0.8～1.2ml溶液B、18～22μL溶液A，置于50～58℃水浴18～22min后，加入80～120μL溶液C、80～120μL溶液D、550～650μL溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：向增旭，张成才，何超，张子璇，王红娟，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32