一种麦角甾醇联合吉非替尼的用途制造技术

本发明专利技术涉及一种用于治疗非小细胞肺癌的联合用药，尤其涉及麦角甾醇联合吉非替尼的用途。属于生物医药技术领域。通过体外培养肺癌A549细胞，PC‑9细胞进行药物对肿瘤的抑制作用研究。采用两种细胞系（分别对GEF敏感的PC‑9细胞和耐药的A549细胞），进行MTT试验；Hochest33258细胞凋亡试验；流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期；Western‑blots试验考察细胞EGFR信号通路的影响。初步探讨ERG与GEF联用是否具有协同抗肺癌的作用，能否针对敏感细胞株达到增效、增敏的效果，能否增加耐药细胞株的敏感性，以及对非小细胞肺癌的治疗作用及机制研究。

The use of ergosterol combined with gefitinib

【技术实现步骤摘要】
一种麦角甾醇联合吉非替尼的用途
本专利技术涉及一种用于治疗非小细胞肺癌的联合用药，尤其涉及麦角甾醇联合吉非替尼的用途。属于生物医药

技术介绍
由于癌症发病率和死亡率的持续增高，目前仍然是世界上最关注的难题之一。据统计，2015年中国大约新增了约430万例癌症病例，以及有约281万例癌症患者死亡，其中肺癌占据首位。国际癌症研究机构（InternationalAgencyforResearchonCancer）编制的《2018年全球癌症发病率和死亡率估计》提供了一份全球癌症负担状况报告，预计2018年将有1810万新癌症病例和960万癌症死亡病例。其中肺癌是最常见的癌症（占总病例的11.6%），也是癌症死亡的主要原因（占总癌症死亡人数的18.4%）。临床上发现，肺腺癌已经逐渐替代肺鱗癌成为肺癌发病率最高的病理类型，约占NSCLC的一半，而NSCLC约占全部肺癌的85％。目前，临床一线化疗用药（铂类，阿霉素，紫杉醇等）在化疗过程中，均会出现多药耐药现象，最终导致疾病进一步进展。GEF是最早用于治疗NSCLC的分子靶向药物，目前常用于二线治疗药物应用于临床。GEF是一种表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂，针对EGFR靶点的NSCLC具有较好的临床治疗效果。其作用机制主要通过与三磷酸腺苷（ATP）竞争和EGFR的结合，通过AKT等途径阻断EGFR信号传导通路，抑制自身磷酸化以及活化，阻断表达EGFR的肿瘤细胞生长，阻断PI3K-AKT等下游信号通路，诱导肿瘤细胞凋亡，起到抗肿瘤作用。对于发生EGFR突变的患者，GEF副作用的发生程度相较于化疗明显减轻。同时研究表明在女性患者、亚裔患者以及不吸烟患者中更多的观察到EGFR基因的突变。报道显示，东方国家的肺癌患者在临床上GEF的疗效往往都要好于西方国家。可见，GEF的深入研究对亚洲NSCLC患者有重要意义。针对肺癌，寻找一种能够与GEF产生协同作用的药物，拓展GEF的应用范围，改善靶向药物在肺癌治疗方面的临床应用，具有重要价值。
技术实现思路
本专利技术要解决上述问题，通过体外培养肺癌A549细胞，PC-9细胞进行药物对肿瘤的抑制作用研究。采用两种细胞系（分别对GEF敏感的PC-9细胞和耐药的A549细胞），进行MTT试验；Hochest33258细胞凋亡试验；流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期；Western-blots试验考察细胞EGFR信号通路的影响。初步探讨ERG与GEF联用是否具有协同抗肺癌的作用，能否针对敏感细胞株达到增效、增敏的效果，能否增加耐药细胞株的敏感性，以及对非小细胞肺癌的治疗作用及机制研究。本专利技术解决上述问题的技术方案如下：麦角甾醇联合吉非替尼在制备治疗非小细胞肺癌药物方面的用途。作为上述技术方案的优选，治疗机理基于麦角甾醇联合吉非替尼对PC-9细胞和/或A549细胞的协同抑制作用。作为上述技术方案的优选，治疗机理基于麦角甾醇联合吉非替尼对PC-9细胞和/或A549细胞的协同诱导凋亡作用。作为上述技术方案的优选，所述协同抑制作用基于麦角甾醇与吉非替尼的联用对A549细胞和/或PC-9细胞，增加G0/G1期阻滞，减少细胞周期S期比例。作为上述技术方案的优选，所述协同诱导凋亡作用基于麦角甾醇与吉非替尼的联用对A549细胞和/或PC-9细胞，抑制EGFR信号通路的表达。作为上述技术方案的优选，所述EGFR信号通路为P13K/AKT/mTOR信号通路。作为上述技术方案的优选，所述麦角甾醇的药物浓度为5~320μm，所述吉非替尼的药物浓度为0.625~40μm。作为上述技术方案的优选，所述麦角甾醇的药物浓度为20~40μm，所述吉非替尼的药物浓度为2.5~5μm。作为上述技术方案的优选，所述麦角甾醇的药物浓度为20~80μm，所述吉非替尼的药物浓度为5~40μm。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术通过体外培养肺癌A549细胞，PC-9细胞进行药物对肿瘤的抑制作用研究。采用两种细胞系（分别对GEF敏感的PC-9细胞和耐药的A549细胞），进行MTT试验；Hochest33258细胞凋亡试验；流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期；Western-blots试验考察细胞EGFR信号通路的影响。得出ERG与GEF联用具有协同抗肺癌的作用，在一定程度上证明了对GEF敏感的PC-9细胞能够起到增效、增敏作用，对GEF耐药的A549细胞能够增加其一定的敏感性。附图说明图1为两单药组与联用组不同作用时间点下的549细胞抑制率；图2为两单药组不同作用时间点下的IC50值；图3为ERG与GEF联用对A549细胞协同抑制作用的q值；图4为两单药组与联用组不同作用时间点下的PC-9细胞抑制率；图5为两单药组不用作用时间点下的IC50值；图6为ERG与GEF联用对A549细胞协同抑制作用的q值；图7为ERG与GEF作用A549细胞的细胞凋亡率；图8为ERG与GEF作用PC-9细胞的细胞凋亡率；图9为ERG与GEF作用A549细胞的周期分布情况；图10为ERG与GEF作用PC-9细胞的周期分布情况；图11为不同药物作用时间对A549肺癌细胞的抑制率；图12为不同药物作用时间对PC-9肺癌细胞的抑制率；图13为ERG与GEF作用A549细胞染色后的细胞核；图14为ERG与GEF作用PC-9细胞染色后的细胞核；图15为ERG与GEF作用A549细胞后的细胞凋亡情况；图16为ERG与GEF作用PC-9细胞后的细胞凋亡情况；图17为ERG与GEF作用A549细胞的细胞周期；图18为ERG与GEF作用PC-9细胞的细胞周期；图19为ERG与GEF给药于A549和PC-9细胞上的蛋白表达情况及定量分析。具体实施方式以下结合附图对本专利技术进行进一步的解释说明。麦角甾醇联合吉非替尼体外诱导非小细胞肺癌细胞凋亡的作用机理研究一、实验材料人肺癌细胞A549来源于中国科学院生命科学研究院细胞库，人肺癌细胞PC-9来源于上海名劲生物科技有限公司。二、方法与结果（一）细胞培养将细胞接入细胞培养瓶中，加入含10%胎牛血清（FBS）的完全培养基5~6ml，吹匀后置于37℃、5%CO2培养箱中，每天观察细胞生长状态，2~3天更换一次培养基，待细胞长满至培养瓶底部面积的80%左右时进行细胞传代或冻存。（二）细胞传代待细胞长满至80%时进行传代：弃去培养基，用磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗3次，每次2ml左右。弃去PBS后，加入0.25%胰蛋白酶液1ml，待细胞消化完毕加入培养液终止消化。800rpm·min-1离心5min后，弃去上清液，加入含10%FBS的培养基吹匀，用细胞计数板计数后，分瓶传代培养。（三）细胞冻存收集细胞，计数后加入冻存液（90%FBS+10%二本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.麦角甾醇联合吉非替尼在制备治疗非小细胞肺癌药物方面的用途。/n

【技术特征摘要】
1.麦角甾醇联合吉非替尼在制备治疗非小细胞肺癌药物方面的用途。


2.根据权利要求1所述的用途；其特征在于：治疗机理基于麦角甾醇联合吉非替尼对PC-9细胞和/或A549细胞的协同抑制作用。


3.根据权利要求1所述的用途；其特征在于：治疗机理基于麦角甾醇联合吉非替尼对PC-9细胞和/或A549细胞的协同诱导凋亡作用。


4.根据权利要求2所述的用途；其特征在于：所述协同抑制作用基于麦角甾醇与吉非替尼的联用对A549细胞和/或PC-9细胞，增加G0/G1期阻滞，减少细胞周期S期比例。


5.根据权利要求3所述的用途；其特征在于：所述协同诱导凋亡作用基于麦角甾醇...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄绳武，黄挺，吴梅佳，
申请(专利权)人：浙江中医药大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33