烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2及其编码蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2及其编码蛋白及其在蔗糖酯生物合成中的应用，其编码的蛋白可以在较安全的醋酸铵缓冲液中调控蔗糖二酯的合成，整个蔗糖酯生物催化反应均在醋酸铵缓冲液中进行，除了蔗糖，酰基‑COA以及催化的NtASAT1～NtASAT2蛋白外，没有其他物质加入。整个催化反应体系与以往大多数蔗糖酯合成方法中底物或溶剂需用有毒试剂相比，安全性高，反应底物简单，体系产物相对单一，所有产物均为蔗糖酯，易于后续分离及利用。因此，NtASAT2基因及其蛋白在蔗糖酯生物合成中具有较好的应用价值和前景。

Tobacco acyl glycosyltransferase gene ntasat2 and its coding protein and its application

【技术实现步骤摘要】
烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2及其编码蛋白及其应用
本专利技术涉及烟草酰基糖酰基转移酶基因及其编码蛋白及其在蔗糖酯生物合成中的应用。
技术介绍
蔗糖酯是一类重要的生物表面活性剂，由于其分子结构中含有强亲水性的蔗糖基团和亲油性的脂肪酸基团，所以它具有很强的表面活性，对油和水有良好的乳化作用。由于蔗糖酯的亲水亲油平衡值(HLB)不随温度而变化，其HLB值范围比较宽，既能作W/O型乳化剂，又可以作O/W型乳化剂。蔗糖酯具有良好的乳化、分散、增溶、渗透、起泡、粘度调节、防止老化、抗菌等性能，同时它无毒，尤其对人体安全、无刺激性、可降解，不会造成环境污染，因而其被广泛应用于食品、医药、化工、化妆品、石油开采、水果保鲜、纺织品及农业等行业。蔗糖酯是联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)推荐使用的食品添加剂和药用原料，我国也于20世纪80年代批准使用。关于蔗糖酯的合成方法，主要包括酰氯酯化法、直接脱水法、酯交换法以及微生物法等4种。酰氯酯化法因需毒性较大的含氮有机化合物作溶剂,使该法生产的产品很难达到食品、化妆品和药品用标准的要求,因此目前较多的用于蔗糖酯杀虫剂的生产。直接脱水法是在强酸(对甲苯磺酸)为催化剂,极性非质子有机溶剂DMF作为溶剂的条件下进行,该法过程简单,易于操作,但DMF毒性大,产品难于纯化,且酸性条件下蔗糖容易分解,导致产率低。酯交换法包括溶剂法和无溶剂法，其中溶剂法由于溶剂有毒,易在成品中残留,精制成食品级设备投资大,生产成本高,所以到目前为止溶剂法在工业上基本已被淘汰。无溶剂法由于需要在很高的温度下使反应物达到熔融的状态，易产生焦化，使产品质量难以得到保证。微生物法也称酶催化法,随着生物工程技术的发展,人们发现某些微生物可催化合成蔗糖酯，酶催化法也主要包括有溶剂和无溶剂两种。与传统的化学方法相比,酶催化法具有催化活性高,反应温和,选择性强等优点。酶法合成的蔗糖酯不仅具有乳化润湿和增容等表面活性而且具有抗肿瘤的性能。但是有溶剂酶催化法，仍然存在溶剂具有毒性的问题，在食品和化妆品等领域的应用受限。由于糖酯具有多种医疗、保健功能,深入研究开发有着广阔的市场前景和发展潜力。并且它在食品工业中的应用前景已为人们所认识。因此，无溶剂酶催化以及探寻新的酶催化方法，已经成为蔗糖酯合成的一个发展方向。
技术实现思路
本专利技术的目的是提出了一种烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2及其编码蛋白及其在蔗糖酯生物合成中的应用，其编码的蛋白可以在较安全的醋酸铵缓冲液中调控蔗糖二酯的合成。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2，所述烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2的核苷酸序列如SEQIDNO:7。进一步，基因NtASAT2编码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:8。进一步，烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2的克隆前引物的序列如SEQIDNO:9，该基因的克隆后引物序列如SEQIDNO:10。进一步，载有基因NtASAT2的单克隆重组质粒的制备方法如下：以普通烟草(N.tabacum)腺毛cDNA为模板，利用基因NtASAT2的克隆引物进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收基因的目的条带，将基因片段连接到克隆载体，加连接产物于大肠杆菌感受态中，冰浴，冰浴完成后，放入水浴锅中热激，然后再次冰浴后，加入液体培养基摇床孵育，离心后去除部分上清液，剩余菌液涂布固体培养基，培养箱中培养，挑选白色单克隆菌，利用载体引物扩增验证，验证阳性的克隆送去测序，获得测序正确、载有基因NtASAT2的单克隆重组质粒载体。进一步，基因NtASAT2表达载体构建所用引物P-NtASAT2_F以及P-NtASAT2_R，其中P-NtASAT2_F的序列为SEQIDNO:11；P-NtASAT2_R的序列为SEQIDNO:12。进一步，基因NtASAT2表达载体构建方法如下：获得的NtASAT2的阳性单克隆质粒载体为模板，以P-NtASAT2_F与P-NtASAT2_R为引物进行扩增，回收的目的基因片段，将目的基因片段与同源重组酶混合，将连接产物转化感受态，培养，菌落PCR鉴定，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，分别挑选1-3个阳性克隆进行测序，测序正确的单菌落菌株过夜培养，离心收集菌体，提取质粒。进一步，基因NtASAT2的蛋白表达方法如下：将质粒转化大肠杆菌感受态，菌种活化、小体系诱导表达及条件筛选，根据小体系表达情况，选择最佳诱导表达条件，大体系放大表达及蛋白纯化。进一步，烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2编码的蛋白调控蔗糖酯合成中的应用。进一步，NtASAT2蛋白以NtASAT1基因编码的NtASAT1蛋白催化产生的蔗糖单酯为受体底物，以酰基-COA为酰基链供体底物，催化产生蔗糖二酯。进一步，烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2编码的蛋白调控蔗糖酯合成的方法，在醋酸铵缓冲液中，加入NtASAT1基因编码的NtASAT1蛋白，加入异戊酰-COA，加入蔗糖，温育反应后，加热，然后冰浴降温后，加入NtASAT2蛋白，再加入异戊酰-COA，温育，之后加入乙腈、异丙醇和甲酸混合液终止反应，离心，上清液过有机滤膜，得到蔗糖二酯。进一步，所述NtASAT1基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1，NtASAT1蛋白的序列为SEQIDNO:2，NtASAT1基因的克隆前引物的序列如SEQIDNO:3，NtASAT1基因的克隆后引物序列如SEQIDNO:4，NtASAT1基因表达载体构建所用引物P-NtASAT1_F以及P-NtASAT1_R，其中P-NtASAT1_F的序列为SEQIDNO:5；P-NtASAT1_RF的序列为SEQIDNO:6。本专利技术的有益效果为：本专利技术烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2及其编码蛋白及其在蔗糖酯生物合成中的应用，其编码的蛋白可以在较安全的醋酸铵缓冲液中调控蔗糖二酯的合成，整个蔗糖酯生物催化反应均在醋酸铵缓冲液中进行，除了蔗糖，酰基-COA以及催化的NtASAT1～NtASAT2蛋白外，没有其他物质加入。整个催化反应体系与以往大多数蔗糖酯合成方法中底物或溶剂需用有毒试剂相比，安全性高，反应底物简单，体系产物相对单一，所有产物均为蔗糖酯，易于后续分离及利用。因此，NtASAT2基因及其蛋白在蔗糖酯生物合成中具有较好的应用价值和前景。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术NtASAT1～NtASAT2基因片段.Marker为DL5000；图2为NtASAT1～NtASAT2的亚克隆片段，其中1对应NtASAT1基因,2对应NtASAT2基因，Marker为DL10000；图3为图1所示NtASAT1重组表达载体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2，其特征在于:所述烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7。/n

【技术特征摘要】
1.一种烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2，其特征在于:所述烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2的核苷酸序列如SEQIDNO:7。


2.如权利要求2所述的烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2编码的蛋白，其特征在于：该蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:8。


3.如权利要求1所述的烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2，其特征在于:该基因的克隆前引物的序列如SEQIDNO:9，该基因的克隆后引物序列如SEQIDNO:10。


4.如权利要求3所述的烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2，其特征在于，载有基因NtASAT2的单克隆重组质粒的制备方法如下：以普通烟草(N.tabacum)腺毛cDNA为模板，利用基因NtASAT2的克隆引物进行PCR扩增，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收基因的目的条带，将基因片段连接到克隆载体，加连接产物于大肠杆菌感受态中，冰浴，冰浴完成后，放入水浴锅中热激，然后再次冰浴后，加入液体培养基摇床孵育，离心后去除部分上清液，剩余菌液涂布固体培养基，培养箱中培养，挑选白色单克隆菌，利用载体引物扩增验证，验证阳性的克隆送去测序，获得测序正确、载有基因NtASAT2的单克隆重组质粒载体。


5.如权利要求4所述的烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2，其特征在于，基因NtASAT2表达载体构建所用引物P-NtASAT2_F以及P-NtASAT2_R，其中P-NtASAT2_F的序列为SEQIDNO:11；P-NtASAT2_R的序列为SEQIDNO:12。


6.如权利要求5所述的烟草酰基糖酰基转移酶基因NtASAT2，其特征在于，基因NtASAT2表达载体构建方法如...

【专利技术属性】
技术研发人员：常爱霞，王元英，杨爱国，陈铭，李洋洋，陈彪，张玉，罗成刚，任民，冯全福，
申请(专利权)人：中国农业科学院烟草研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37