具有改善的铁硫簇递送的细胞工厂制造技术

本发明专利技术提供了一种能够改善铁硫簇递送的经遗传修饰的细菌细胞，其特征在于编码突变的铁硫簇调节因子(IscR)的经修饰的基因以及编码增强生物素、硫辛酸或硫胺素的生物合成的多肽的一种或多种转基因。本发明专利技术提供了一种使用本发明专利技术的经遗传修饰的细菌生产生物素、硫辛酸或硫胺素的方法；以及所述经遗传修饰的细菌细胞在生产生物素、硫辛酸或硫胺素中的应用。

Cell factory with improved iron sulfur cluster delivery

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有改善的铁硫簇递送的细胞工厂
本专利技术涉及能够改善铁硫簇递送的经遗传修饰的细菌细胞，其特征在于编码突变的铁硫簇调节因子(IscR)的经修饰的基因以及编码增强生物素、硫辛酸或硫胺素的生物合成的多肽的一种或多种转基因。本专利技术还涉及一种使用本专利技术的经遗传修饰的细菌生产生物素、硫辛酸或硫胺素的方法；以及所述经遗传修饰的细菌细胞在生产生物素、硫辛酸或硫胺素中的用途。
技术介绍
生物素(又称为维生素B7或维生素H)和硫胺素(又称为维生素B1)是人类必需的饮食维生素，因为人类与其他后生动物一样不能产生生物素或硫胺素。硫辛酸(LA)是一种含硫的类维生素抗氧化剂，其在细菌、植物和动物中少量合成。这三种都被广泛用作饮食补充剂。目前，这些维生素或类维生素化合物的生产依赖于化学合成，这是昂贵的。制造它们的生物合成方法将提供一种替代性的、更具成本效益的方式来满足当前和未来的需求。生物素是催化某些羧化反应的酶(例如乙酰辅酶A羧化酶(ACC))的必需辅因子。ACC存在于所有生命形式中，其产生丙二酰辅酶A，丙二酰辅酶A是脂肪酸生物合成的关键组成要素。在自然界中，生物素是通过涉及脂肪酸生物合成途径的线性途径合成的。大肠杆菌(E.coli)中生物素合成的最初底物是丙二酰-ACP，它也是脂肪酸合成的起始代谢物。在进入脂肪酸循环之前，丙二酰-ACP被SAM(S-腺苷甲硫氨酸)依赖性甲基转移酶BioC掩盖，从而生成丙二酰-ACP甲酯。随后，两轮脂肪酸链延长反应产生了庚二酰基酯-ACP分子。庚二酰基酯-ACP的O-甲基被专门的酯酶BioH水解，使该分子退出脂肪酸延伸循环。随后，中间体庚二酰基酯-ACP通过生物素特异性途径转化为生物素(图1A)。在该途径中，BioF催化庚二酰-ACP与丙氨酸的PLP依赖性脱羧醛醇缩合反应，生成KAPA(8-氨基-7-氧代壬酸)。BioA(和BioK)催化KAPA的PLP依赖性转氨作用，生成DAPA(7,8-二氨基壬酸)，其中供体为SAM；以及副产物S-腺苷-氧代甲硫氨酸。BioD催化ATP驱动的羧化反应和DAPA的闭环反应，以在脱硫生物素(DTB)中形成噻吩烷环。生物素合成途径的最后一步是已知的最复杂的反应之一，因为它涉及通过BioB(生物素合酶)在两种烃之间引入硫桥，以产生生物素。BioB是S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM或AdoMet)自由基酶，被发现为二聚体，并在其活性位点包含两个铁硫簇：[2Fe-2S]2+和[4Fe-4S]2+。认为在DTB中形成噻吩烷环所需的硫原子是从BioB的[2Fe-2S]2+簇中募集的。结果，DTB的合成中所消耗的BioB二聚体中的铁硫簇被认为在每一轮催化后都再生。硫辛酸(LA)不仅是强效的活性氧物质清除剂(因此是一种重要的抗氧化剂)，还是α-酮酸脱氢酶的辅因子。LA是从脂肪酸代谢的中间体从新合成的(图2)。参与大肠杆菌的LA合成的三种酶是LplA(硫辛酸-蛋白连接酶)、LipB(辛酰蛋白ACP载体蛋白：蛋白转移酶)和LipA(硫辛酸合酶)。由lplA基因编码的LplA能够以ATP依赖性方式催化外源辛酸与靶酶的E2亚基的未硫辛酰化的脱辅硫辛酰基结构域的结合。由lipB基因编码的LipB能够催化辛酰基残基从ACP转移到靶酶的E2亚基的脱辅硫辛酰基结构域。AceF基因编码丙酮酸脱氢酶的E2亚基的硫辛酰基结构域。由lipA基因编码的LipA负责形成两个C-S键。LipA驱动的反应需要铁硫簇(4Fe-4S)和SAM(由metK基因产生)来执行其功能。硫辛酸主要作为多种多酶复合体中的与蛋白结合的硫辛酰胺部分存在于细胞中。硫胺素的生物合成已经在细菌、某些原生动物、植物和真菌中得到了表征。硫胺素的噻唑和嘧啶部分是分别合成的(图3)。嘧啶部分，即4-氨基-5-羟甲基-2-甲基嘧啶磷酸(HMP-P)源自5-氨基咪唑核糖核苷酸(AIR)，其是嘌呤从新生物合成途径中的中间体。在革兰氏阴性细菌中，thiC基因产物HMP-P合酶(其结合1个[4Fe-4S]簇/亚基)在自由基S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)依赖性反应中催化AIR向HMP-P的转化。然后，在与噻唑单元偶联之前，HMP-P被ThiD激酶磷酸化为HMP-PP。噻唑部分5-(2-羟乙基)-4-甲基噻唑磷酸(HET-P)源自L-酪氨酸和1-脱氧-D-木酮糖磷酸(DXP)和半胱氨酸；其中硫原子可能来自L-半胱氨酸。由thiH基因编码的酪氨酸裂解酶以每个亚基结合1个[4Fe-4S]簇，并催化酪氨酸发生自由基介导的裂解，变为2-亚氨基乙酸和4-甲酚。噻唑部分的合成需要至少五种基因thiF、thiS、thiG、thiH和thiI的表达。然后，thiE编码的硫胺素-磷酸合酶(EC2.5.1.3)的作用使嘧啶和噻唑部分结合形成TMP。因此，TMP是所有已知的硫胺素生物合成途径的第一个产物。在大肠杆菌和其他肠杆菌科菌(Enterobacteriaceae)中，在ATP存在下，thiL编码的硫胺素-磷酸激酶(EC2.7.4.16)可以将TMP磷酸化为辅因子TPP。包含表达硫胺素单磷酸磷酸酶(E.C3.1.3-)的转基因的细菌菌株能够将TMP转化为硫胺素，从而提高硫胺素产量。基于细菌的细胞工厂的应用是生物素、硫辛酸和硫胺素的生物合成生产的潜在途径。由于以下事实，重组大肠杆菌作为生产生物产品的细胞工厂的优势得到了广泛认可：(i)其具有无与伦比的快速生长动力学；在葡萄糖-盐培养基中和最佳环境条件下培养时，其倍增时间约为20分钟；(ii)容易获得高细胞密度；其中大肠杆菌液体培养物的理论密度极限据估算为约200g细胞干重/l或约1×1013个活细菌/mL。此外，有许多分子工具和操作规程可用于大肠杆菌的遗传修饰，并且其是适合表达异源蛋白的生物体；这两点对于获得所需生物产品的高产量而言可能是必不可少的。在大肠杆菌中，生物素操纵子结构在相反链(bioO基因座)上的重叠启动子的控制下分割为bioA和bioBFCD，而bioH位于大肠杆菌染色体上的其他位置。生物素操纵子的表达被结合生物素的阻遏物(BirA)下调，BirA与生物素操纵子中的操纵基因结合。BirA还起到生物素连接酶的作用，将生物素转移至细胞羧化酶。BirA的功能从生物素连接酶到转录阻遏物的切换受到相应的细胞内生物素和脱辅羧化酶库的调节。据报道，在大肠杆菌中过表达生物素操纵子(bioA和bioBFCD)对生长有抑制作用(Ifuku,O等，1995)。由于这种抑制的原因尚不清楚，这对增强生物素合成产生了阻碍。通常，需要确定这些复杂的生物合成途径中的瓶颈以例如促进细菌类细胞工厂(例如大肠杆菌)中的生物素、硫辛酸和硫胺素的生产，定制这些途径来克服可能限制其生长和产生高水平的相应途径酶的能力的多种因素。
技术实现思路
根据第一实施方式，本专利技术提供了一种经遗传修饰的细菌，其用于增强生物素、硫辛酸或硫胺素中任一种的生产；其中，所述细菌包含：·编码突变IscR多肽的经遗传修饰的内源iscR基因，其中所述突变IscR多肽的氨基酸序列与SEQIDNo:2、4、6、8、10、12和14具有至少8本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于增强生物素或硫辛酸或硫胺素的生产的经遗传修饰的细菌；其中，所述细菌包含：/na.编码突变IscR多肽的经遗传修饰的内源iscR基因，其中所述突变IscR多肽的氨基酸序列与选自由SEQ ID No:2、4、6、8、10、12和14组成的组的序列具有至少80％的氨基酸序列同一性，并且其中，所述氨基酸序列具有选自由以下组成的组的至少一种氨基酸置换：/ni.L15X、C92X、C98X、C104X和H107X；其中X是除SEQ ID No:2、4、6、8、10、12和14中的对应氨基酸残基以外的任何氨基酸，/n和/nb.编码选自由以下组成的组的多肽的至少一种转基因：/nii.具有生物素合酶活性(EC 2.8.1.6)的多肽，/niii.具有硫辛酸合酶活性(EC 2.8.1.8)的多肽，/niv.具有HMP-P合酶活性(EC 4.1.99.17)的多肽，和/nv.具有酪氨酸裂解酶活性(EC 4.1.99.19)的多肽。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170714 EP 17181503.81.一种用于增强生物素或硫辛酸或硫胺素的生产的经遗传修饰的细菌；其中，所述细菌包含：
a.编码突变IscR多肽的经遗传修饰的内源iscR基因，其中所述突变IscR多肽的氨基酸序列与选自由SEQIDNo:2、4、6、8、10、12和14组成的组的序列具有至少80％的氨基酸序列同一性，并且其中，所述氨基酸序列具有选自由以下组成的组的至少一种氨基酸置换：
i.L15X、C92X、C98X、C104X和H107X；其中X是除SEQIDNo:2、4、6、8、10、12和14中的对应氨基酸残基以外的任何氨基酸，
和
b.编码选自由以下组成的组的多肽的至少一种转基因：
ii.具有生物素合酶活性(EC2.8.1.6)的多肽，
iii.具有硫辛酸合酶活性(EC2.8.1.8)的多肽，
iv.具有HMP-P合酶活性(EC4.1.99.17)的多肽，和
v.具有酪氨酸裂解酶活性(EC4.1.99.19)的多肽。


2.如权利要求1所述的用于增强生物素或硫辛酸或硫胺素的生产的经遗传修饰的细菌，其中，所述突变IscR多肽中的所述至少一种氨基酸置换选自由以下组成的组：
a.L15X，其中X是F、Y、M和W中的任一个；
b.C92X，其中X是Y、A、M、F和W中的任一个；
c.C98X，其中X是A、V、I、L、F和W中的任一个；
d.C104X，其中X是A、V、I、L、F和W中的任一个；和
e.H107X，其中X是A、Y、V、I和L中的任一个。


3.如权利要求1或2所述的经遗传修饰的细菌，其中，所述至少一种转基因编码具有生物素合酶活性(EC2.8.1.6)的多肽，所述细菌还包含编码一种或多种选自由以下组成的组的多肽的其他转基因：
a.具有SAM(S-腺苷甲硫氨酸)依赖性甲基转移酶活性(EC2.1.1.197)的多肽；
b.具有7-酮-8-氨基壬酸(KAPA)合酶活性(EC2.3.1.47)的多肽；
c.具有7,8-二氨基壬酸(DAPA)合酶活性(EC:2.6.1.62或EC:2.6.1.105)的多肽；和
d.具有脱硫生物素(DTB)合酶活性(EC6.3.3.3)的多肽，
e.具有庚二酰基-[酰基-载体蛋白]甲基酯酯酶活性(EC3.1.1.85)的多肽，和
f.具有6-羧基己酸-CoA连接酶活性(EC6.2.1.14)的多肽；
其中，所述细菌用于增强生物素的生产。


4.如权利要求1或2所述的经遗传修饰的细菌，其中，所述至少一种转基因编码具有硫辛酸合酶活性(EC2.8.1.8)的多肽，所述细菌还包含编码一种或多种选自由以下组成的组的多肽的其他转基因：
a.具有辛酰基转移酶活性(EC2.3.1.181)的多肽，
b.包含丙酮酸脱氢酶(EC2.3.1.12)的二氢硫辛酰基赖氨酸残基乙酰转移酶组分的多肽，和
c.具有硫辛酸-蛋白连接酶A活性(EC:6.3.1.20)的多肽。
其中，所述细菌用于增强硫辛酸的生产。


5.如权利要求1或2所述的经遗传修饰的细菌，其中，所述至少一种转基因编码具有HMP-P合酶活性(EC4.1.99.17)的多肽，和/或一种转基因编码具有酪氨酸裂解酶活性(EC4.1.99.19)的多肽，所述细菌还包含编码一种或多种选自由以下组成的组的多肽的其他转基因：
a.具有ThiS腺苷酰基转移酶活性(EC2.7.7.73)的ThiF多肽；
b.具有硫胺素磷酸合酶活性(EC2.5.1.3)的ThiE多肽；
c.具有噻唑合酶活性(E.C2.8.1.10)的ThiG多肽；
d.具有磷酸羟甲基嘧啶激酶活性(EC2.7.4.7)的ThiD多肽；
e.具有甘氨酸氧化酶活性(EC1.4.3.19)的ThiO多肽；
f.具有硫载体蛋白活性的ThiS多肽；
g.具有羟乙基噻唑激酶活性(2.7.1.50)的ThiM多肽；
和
h.具有硫胺素单磷酸磷酸酶活性(E.C3.1.3.-)的多肽；
其中，所述细菌用于增强硫胺素的生产。


6.如权利要求5所述的经遗传修饰的细菌，其中，所述细菌包含编码以下多肽的其他转基因：
a.具有HMP-P合酶活性(EC4.1.99.17)的ThiC多肽；
b.具有酪氨酸裂解酶活性(EC4.1.99.19)的ThiH多肽或具有甘氨酸氧化酶活性(EC1.4.3.19)的ThiO多肽；
c.具有ThiS腺苷酰基转移酶活性(EC2.7.7.73)的ThiF多肽；
d.具有硫胺素磷酸合酶活性(EC2.5.1.3)的ThiE多肽；
e.具有噻唑合酶活性(E.C2.8.1.10)的ThiG多肽；
f.具有磷酸羟甲基嘧啶激酶活性(EC2.7.4.7)的ThiD多肽；
g.具有硫载体蛋白活性的ThiS多肽；和
h.具有硫胺素单磷酸磷酸酶(E.C3.1.3.-)活性的多肽。


7.如权利要求1至6中任一项所述的经遗传修饰的细菌，其中，所述至少一种转基因和所述一种或多种其他转基因与组成型启动子可操作地连接。
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【专利技术属性】
技术研发人员：H·J·吉尼，A·P·巴利，N·迈岺彼得森，
申请(专利权)人：毒菌公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK