一种基因VII型新城疫病毒弱毒株及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种自然分离的基因VII型新城疫病毒弱毒株，该毒株未进行任何基因改造，保持了该病毒作为流行毒株所具备的天然的免疫原性。本发明专利技术所提供的基因VII型弱毒株，其保藏号为：V201968。本发明专利技术分离的基因VII型新城疫病毒弱毒株NDV‑VII用于制备疫苗。本发明专利技术毒株是自然分离得到的，该毒株对鸡胚最小致死量的平均致死时间为138h，1日龄雏鸡脑内接种致病指数为0.16，6周龄鸡静脉接种致病指数为0，本发明专利技术毒株具有稳定遗传性，在鸡胚上连续传代15代，其F基因并未发生致病力增强的突变。传统疫苗株LaSota株免疫保护效力比对试验证明，本发明专利技术毒株制备活疫苗免疫后抗体产生水平高于对照组，免疫后攻毒实验证明该毒株能够对鸡只提供完全保护。

A weak strain of Newcastle disease virus type VII and its application

【技术实现步骤摘要】
一种基因VII型新城疫病毒弱毒株及其应用
本专利技术涉及兽医病毒分子生物学与免疫学领域，具体涉及一株基因VII型新城疫病毒弱毒株。技术背景新城疫(NewcastleDisease，ND)是由新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus，NDV)引起的一种高度接触性、急性烈性传染病，对世界养禽业危害严重，曾被国际兽疫局(OIE)列为A类病。该病毒基因组为单股负链RNA，宿主范围广，其中以鸡的易感性最高，且幼龄鸡的发病率和死亡率明显高于成年鸡，该病一年四季均可流行。NDV只有一个血清型，利用F基因进行遗传进化分析，可分为ClassI和ClassⅡ两大类群，ClassI类群分为18个基因型，几乎包含所有强毒株及广泛流行毒株。中国动物卫生与流行病学中心吴延功等人对我国2010年以前分离的535株禽源NDV进行流行病学调查分析，发现我国鸡群流行NDV基因型主要为基因VII型。2013年刘华雷等人对全国20省共8510份家禽样品进行流行病学调查发现，我国NDV流行毒株主要为基因VII型。吉林大学薛聪等对2013-2017年东北地区禽源NDV分离株基因分析，NDV主要流行毒株基因型为基因VII型。此外中国周边的韩国和日本流行的NDV也大都为基因VII型。综上所述，有效防控基因VII型NDV的流行对我国ND的净化及活禽市场健康发展具有重要意义。疫苗是防控传染病最经济有效的手段，自ND流行以来，最初使用灭活疫苗，但该种疫苗存在生产成本高，粘膜免疫及细胞免疫效果差等局限，随着越来越多弱毒株的分离，活疫苗所占份额持续增加。当前我国对ND防控主要使用的LaSota株等多为基因II型毒株，与基因VII型毒株遗传距离较大，抗原交叉保护力较低，不能对新城疫病毒基因VII型流行株提供完全有效的保护。由于绝大多数分离到的基因VII型NDV流行毒株均为强毒株，虽然能够迅速产生抗体，但是免疫鸡易产生食欲不振、产蛋下降、带毒散毒等不良反应，对生态环境造成危害，因此强毒并不适合制备疫苗，因此获得基因VII型弱毒株是疫苗制备的关键。而且当前获得弱毒株的手段主要是通过反向遗传技术对强毒株进行改造，获得的重组毒经过基因改造，有毒力返强的风险，且毒力很难完全致弱。而自然弱毒株是病毒在长期的自然演化过程中形成的，遗传稳定性好，克服了人工改造毒株毒力易返强的缺点，应用前景更好。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种自然分离的基因VII型新城疫病毒弱毒株，该毒株未进行任何基因改造，保持了该病毒作为流行毒株所具备的天然的免疫原性，能用于制备基因VII型新城疫病毒疫苗，为我国提供可靠的基因VII型弱毒活疫苗候选疫苗。本专利技术提供一种自然分离到的基因VII型新城疫病毒NDV-VII株，于2019年10月15日保藏在位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCNO:V201968。本专利技术分离的基因VII型新城疫病毒弱毒株NDV-VII用于制备疫苗；所述的疫苗，优选为活疫苗。本专利技术再一个方面提供一种疫苗，其中抗原为上述的基因VII型新城疫病毒弱毒株NDV-VII株。本专利技术还提供NDV-VII株的F基因，其氨基酸序列为SEQIDNO:2,一种编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1,本专利技术还提供NDV-VII株的全基因组，其核苷酸序列为SEQIDNO:3。本专利技术毒株是自然分离得到的，该毒株对鸡胚最小致死量的平均致死时间(MDT)为138h，1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为0.16，6周龄鸡翅静脉接种致病指数(IVPI)为0，本专利技术毒株具有稳定遗传性，在鸡胚上连续传代15代，其F基因并未发生致病力增强的突变。传统疫苗株LaSota株免疫保护效力比对试验证明，本专利技术毒株制备活疫苗免疫后抗体产生水平高于对照组，免疫后攻毒实验证明该毒株能够对鸡只提供完全保护。附图说明图1：NDV-VII株F片段PCR鉴定结果；图2：NDV-VII株全基因组9个片段PCR扩增电泳图；图3：对F片段构建的系统发育树。具体实施方式本专利技术所涉及生物材料：LaSota活疫苗由青岛易邦生物工程有限公司提供；基因NVII型强毒株JS06/02株由本公司保存；H5、H7、H9亚型AI及ND标准阳性血清均购自中国兽医药品监察所。实施例1.NDV弱毒株的筛选及MDT、ICPI、IVPI的测定2019年4月份从山东某地区临床送检鸡病料中分离到一株疑似NDV毒株，命名为NDV-VII株。接种鸡胚收取尿囊液，测定HA效价。连续传代20代，HA效价测定结果显示，该株病毒鸡胚尿囊液的HA效价在鸡胚中传代4代后稳定在9log2。收获的尿囊液进行微量血凝抑制试验(HI)，结果表明，尿囊液样品只与NDV标准阳性血清反应，与H5、H7、H9阳性血清反应阴性。MDT是指最小致死量所能使鸡胚死亡的平均时间，MDT低于60h为强毒力NDV毒株；MDT值在60h-90h之间为中等毒力毒株；MDT大于90h为弱毒株。用无菌生理盐水将新鲜收获的含毒尿囊液作10倍系列稀释，取10-6、10-7、10-8和10-9共4个稀释度，分别接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种5枚，每胚尿囊腔内注射0.1mL。连续观察7日，每天上午和下午各照胚一次，记录每一鸡胚的死亡时间，连续观察7日(结果见表1)。MDT计算公式为：1日龄SPF雏鸡脑内致病指数(ICPI)测定试验：取1日龄SPF雏鸡10只，各脑内注射10-1稀释的新鲜含毒尿囊液0.05mL。以同样方法注射相同剂量的无菌生理盐水作为对照，每组5只。接种后，连续观察8日，每日在相应接种的时间观察，记录雏鸡的情况，分正常(活动灵活，行动无共济失调现象)、发病(包括麻痹、卧地不起，但不包括只表现迟钝的鸡)和死亡，结果见表2。6周SPF龄雏鸡静脉接种致病指数(IVPI)测定试验：PBS10倍稀释新鲜感染尿囊液，取6周龄SPF小鸡10只，各翅静脉接种0.1mL。以同样方法注射相同剂量的无菌生理盐水作为对照，每组5只。接种后，连续观察10日，每日在相应接种的时间观察，记录雏鸡的情况，分正常(活动灵活，行动无共济失调现象)、发病(包括瘫痪、卧地不起，但不包括只表现迟钝的鸡)和死亡，结果见表3。表1：NDV-VII株MDT的测定表2：NDVNDV-VII株ICPI的测定表3：NDVNDV-VII株IVPI测定表1～表3显示，NDV-VII株的MDT为138h，ICPI为0.16，IVPI为0，符合NDV弱毒特征，证明本次分离到的NDV-VII株为弱毒株。对本次筛选获得的基因VII型弱毒株NDV-VII株，于2019年10月15日保藏在位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCNO:V201968。实施例2：NDV-Ⅶ弱毒株F基因鉴定及进化树分析根据NCBI公布的NDV的F基因序列设计引物，上游引物：NDVF-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因VII型弱毒株，其特征在于，所述的弱毒株的保藏编号为V201968。/n

【技术特征摘要】
1.一种基因VII型弱毒株，其特征在于，所述的弱毒株的保藏编号为V201968。


2.权利要求1所述的弱毒株在制备疫苗中的应用。


3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为活毒疫苗。


4.一种疫苗，其特征在于，所述的疫苗中的抗原包含有权...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙化露，楚电峰，于晓璐，孙鹏，侯玉超，李振，范根成，杜元钊，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37