一种静脉血中LEP/APN比值的测得方法技术

本发明专利技术提供一种静脉血中LEP/APN比值的测得方法，包括如下步骤：（1）试剂准备：LEP、APN检测ELISA试剂盒；（2）仪器准备：（2‑1）酶标分析仪；（2‑2）超低温冰箱；（2‑3）台式离心机；（3）实验操作：（3‑1）标本收集：真空负压管收集入选受试者的清晨空腹静脉血，静置30min后，利用台式离心机以3000rpm的速度离心10min后分离血清，置于‑80℃超低温冰箱保存，待检LEP、APN；（3‑2）应用ELISA法测定血清APN及LEP水平；（3‑3）根据结果计算LEP/APN比值。本发明专利技术采用血液标本检测，样本采集简单方便，可以最大程度的降低患者不配合情况的发生。

A method to measure the ratio of LEP / APN in venous blood

【技术实现步骤摘要】
一种静脉血中LEP/APN比值的测得方法
本专利技术属于医学临床检验
，具体涉及一种静脉血中LEP/APN比值的测得方法。本专利技术提供的方法，仅为了获得中间结果LEP/APN比值，不是用于疾病的诊断。
技术介绍
非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD）已被确定为这种原发性肝癌的危险因素之一。由于缺乏统一的监测管理机制，有些NAFLD患者经常在晚期才被诊断为肝细胞癌。因而早期预防和早期治疗，降低NAFLD的发病率，是世界各国基础医学和临床医学面临的新挑战。中国非酒精性脂肪肝的综合分析发现，北京、上海、香港等城市化地区NAFLD的患病率较高分别为39.5%、43.5%和42.0%，台湾老年人（平均年龄70.3岁）其NALFD的患病率高达54.4%。多数NAFLD起病隐匿，早期常缺乏特异的临床表现及典型症状。目前研究表明NAFLD发病机制与胰岛素抵抗存在相关性。胰岛素抵抗和过度肥胖使新增加的脂质涌入肝脏，导致肝脏TG的积累，引起脂肪肝。脂质代谢紊乱状态下，肝内脂肪的动态平衡受到破坏。常见生化指标中高密度脂蛋白胆固醇（high-densitylipoproteincholesterol，HDL-C）具有降脂保护性作用，其含量在BMI>25时显著低于正常水平。随着BMI的增高，体脂肪增加，NAFLD患者血游离脂肪酸（freefattyacid，FFA）和肝合成甘油三酯增加，肝脏合成TG增加，同时清除TG能力均减低；当进入肝脏的FFA和肝脏自身合成的FFA超过肝脏的氧化能力时，肝脏合成的内源性TG不能进行代谢，从而导致脂质在肝细胞内的蓄积。血FFA增加反向抑制胰岛素信号传递，促进NAFLD发生与发展。脂肪因子瘦素（leptin,LEP）与脂联素（adiponectin，APN）在非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholicfattyliverdisease，NAFLD）发生、发展过程中起着非常重要的作用，是目前新型的NAFLD的分子标志物。LEP是一种由脂肪组织分泌的蛋白质类激素。其前体由167个氨基酸残基组成，N末端有21个氨基酸残基信号肽，该前体的信号肽在血液中被切掉而成为146氨基酸，分子量为16kDa。LEP具有广泛的生物学效应，其中较重要的是与下丘脑的LEP受体结合后，发挥抑制食欲，增加能量消耗，抑制脂肪合成的作用，从而达到维持机体代谢平衡的目的。APN是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质，由244个氨基酸组成，因其相对分子量为30kDa，又被称作Acrp30。APN作为一种胰岛素超敏化激素，其水平可随着脂肪含量的增大而减少。且APN具有一定的抗炎作用，因而对肝细胞损伤起到一定的保护作用。LEP是由脂肪细胞合成的分泌型蛋白，因其在肝脏内通过抑制肝细胞的磷酸烯醇丙酮酸羧酶（phosphoenolpyruvatecarboxykinase,PEPCK）的基因表达，引起TG合成增加致使脂质在肝脏的沉积增加而在NAFLD发生、发展中具有重要意义，故将LEP作为肝脂肪变性严重程度的独立预测指标。已有研究显示血浆LEP水平与SP患NALFD的严重程度成正相关。已有研究证实APN水平的降低减少了骨骼肌细胞的脂肪酸氧化、葡萄糖吸收及胰岛素抑制糖原异生作用，同时由于其与肝细胞膜上G蛋白偶联受体的特异性地结合减少，导致其抑制肝糖原生成的能力减弱。同时随着APN水平的降低，其原本抗炎作用也相应减少，对肝细胞损伤无法起到一定的保护作用，增加了患者罹患NAFLD的可能性。LEP和APN是脂肪因子，其在胰岛素抵抗和MetS的发展中具有相反的作用。已经有研究表明LEP/APN值是一般人群中MetS的良好生物标志物，在对SP的研究中，发现除葡萄糖水平外，APN水平与大多数代谢参数呈负相关。除GLU和HDL水平外，LEP/APN值与大多数代谢参数呈正相关，且LEP、APN水平和LEP/APN值存在显着的性别差异，MetS的LEP/APN值的辨别力在男性中比在女性中更好。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种静脉血中LEP/APN比值的测得方法，采用血液标本检测，样本采集简单方便，可以最大程度的降低患者不配合情况的发生。为解决上述技术问题，本专利技术的实施例提供一种静脉血中LEP/APN比值的测得方法，包括如下步骤：（1）试剂准备：LEP、APN检测ELISA试剂盒；（2）仪器准备（2-1）酶标分析仪；（2-2）超低温冰箱；（2-3）台式离心机；（3）实验操作（3-1）标本收集真空负压管收集入选受试者的清晨空腹静脉血，静置30min后，利用台式离心机以3000rpm的速度离心10min后分离血清，置于-80℃超低温冰箱保存，待检LEP、APN；（3-2）应用ELISA法测定血清APN及LEP水平准备：提前20分钟将试剂从超低温冰箱取出，平衡室温；配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水1:20稀释，备用；标准品的溶解：LEP标准曲线：每个标准品加入1.0ml标本通用稀释液，室温放置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀；浓度为2000pg/ml，然后依次稀释成1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml和0pg/ml；APN标准曲线：每个标准品加入1.0ml标本通用稀释液，室温放置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀，浓度为10ng/ml，然后依次稀释成5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.31ng/ml、0.15ng/ml和0ng/ml；编号：将样本对应微孔按序编号；加样：检测APN时，血清用1:2500试剂配套通用稀释液稀释待用，LEP直接加样，分别在相应的孔中加入空白、标准品和待测样本100μl，轻轻振荡混匀，用封板膜封板后置37℃温育90分钟；洗涤：将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干；加生物化素抗体：提前20分钟用生物化抗体稀释液1:30稀释浓缩生物化素抗体配置生物素化抗体工作液，每孔加生物化素抗体100μl，用封板膜封板后置37℃温育60分钟；洗涤：将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干；加酶：提前20分钟用酶结合物稀释液1:30稀释浓缩酶结合物配置酶结合物工作液；每孔加入酶结合物100μl，轻轻振荡混匀，用封板膜封板后置37℃，温育30分钟；洗涤：将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干；显色：每孔加入显色液A、B液各100μl轻轻振荡混匀，37℃避光显色15分钟；测定：每孔加终止液100μl，轻拍混匀，设定酶标分析仪波长450nm，用空白孔调零后测定各孔OD值；数据处理：使用多项式线性拟和方式进行数据处理，以各校准品扣除本底的OD值为纵坐标，各校准品的浓度为横坐标作图，得到标准曲线，样本中的LEP、APN的浓度根据标准曲线计算得出；（本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种静脉血中LEP/APN比值的测得方法，其特征在于，包括如下步骤：/n（1）试剂准备：LEP、APN检测ELISA试剂盒；/n（2）仪器准备/n（2-1）酶标分析仪；/n（2-2）超低温冰箱；/n（2-3）台式离心机；/n（3）实验操作/n（3-1）标本收集/n真空负压管收集入选受试者的清晨空腹静脉血，静置30min后，利用台式离心机以3000rpm的速度离心10min后分离血清，置于-80 ℃超低温冰箱保存，待检LEP、APN；/n（3-2）应用ELISA法测定血清APN及LEP水平/n准备：提前20分钟将试剂从超低温冰箱取出，平衡室温；/n配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水1:20稀释，备用；/n标准品的溶解：/nLEP标准曲线：每个标准品加入1.0 ml标本通用稀释液，室温放置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀；浓度为2000 pg/ml，然后依次稀释成1000 pg/ml、500 pg/ml、250 pg/ml、125 pg/ml、62.5 pg/ml、31.25 pg/ml和0 pg/ml；/nAPN标准曲线：每个标准品加入1.0 ml标本通用稀释液，室温放置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀，浓度为10 ng/ml，然后依次稀释成5 ng/ml、2.5 ng/ml、1.25 ng/ml、0.625ng/ml、0.31 ng/ml、0.15 ng/ml和0 ng/ml；/n编号：将样本对应微孔按序编号；/n加样：检测APN时，血清用1:2500试剂配套通用稀释液稀释待用，LEP直接加样，分别在相应的孔中加入空白、标准品和待测样本100μl，轻轻振荡混匀，用封板膜封板后置37℃温育90分钟；/n洗涤：将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干；/n加生物化素抗体：提前20分钟用生物化抗体稀释液1:30稀释浓缩生物化素抗体配置生物素化抗体工作液，每孔加生物化素抗体100μl，用封板膜封板后置37℃温育60分钟；/n洗涤：将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干；/n加酶：提前20分钟用酶结合物稀释液1:30稀释浓缩酶结合物配置酶结合物工作液；每孔加入酶结合物100μl，轻轻振荡混匀，用封板膜封板后置37℃，温育30分钟；/n洗涤：将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干；/n显色：每孔加入显色液A、B液各100μl轻轻振荡混匀，37℃避光显色15分钟；/n测定：每孔加终止液100μl，轻拍混匀，设定酶标分析仪波长450nm，用空白孔调零后测定各孔OD值；/n数据处理：使用多项式线性拟和方式进行数据处理，以各校准品扣除本底的OD值为纵坐标，各校准品的浓度为横坐标作图，得到标准曲线，样本中的LEP、APN的浓度根据标准曲线计算得出；/n（3-3）根据结果计算LEP/APN比值。/n...

【技术特征摘要】
1.一种静脉血中LEP/APN比值的测得方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）试剂准备：LEP、APN检测ELISA试剂盒；
（2）仪器准备
（2-1）酶标分析仪；
（2-2）超低温冰箱；
（2-3）台式离心机；
（3）实验操作
（3-1）标本收集
真空负压管收集入选受试者的清晨空腹静脉血，静置30min后，利用台式离心机以3000rpm的速度离心10min后分离血清，置于-80℃超低温冰箱保存，待检LEP、APN；
（3-2）应用ELISA法测定血清APN及LEP水平
准备：提前20分钟将试剂从超低温冰箱取出，平衡室温；
配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水1:20稀释，备用；
标准品的溶解：
LEP标准曲线：每个标准品加入1.0ml标本通用稀释液，室温放置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀；浓度为2000pg/ml，然后依次稀释成1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml和0pg/ml；
APN标准曲线：每个标准品加入1.0ml标本通用稀释液，室温放置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀，浓度为10ng/ml，然后依次稀释成5ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml、0.31ng/ml、0.15n...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚敏，虞莹，汪晓莺，姚登福，卢红，张洁，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32