一种评价转基因植物对其内生微生物影响的方法技术

本发明专利技术提供了一种评价转基因植物对其内生微生物影响的方法。其中，分离植物内生微生物的方法包括如下步骤：1)采集目标大小的所述植物，将所述植物的整株植株浸入第一消毒液中进行整体消毒，得到消毒植株；2)从所述消毒植株上获取待分离所述内生菌的部位组织；3)向放有所述组织的容器中加入含有烷基酚聚氧乙烯醚磺化琥珀酸酯的缓冲液，研磨之后得到组织研磨液；4)对所述组织研磨液中的微生物进行培养，以供后续分析。本发明专利技术的方法可用于评价转基因植物对其内生微生物的影响，特别是用于评价转基因植物例如转基因棉花在苗期对其内生微生物的影响。

A method to evaluate the effect of transgenic plants on their endophytes

【技术实现步骤摘要】
一种评价转基因植物对其内生微生物影响的方法
本专利技术提供了一种分离植物内生微生物的方法，特别是其在评价转基因植物对内生微生物影响中的应用。
技术介绍
1996年至2016年间，转基因作物在全球的种植面积为181.5亿公顷(ISAAA，2017年)。转基因作物在很大程度上成功地缓解了许多重大农业挑战，为世界各地的种植者带来了诸多好处。尽管转基因作物给农业生产带来了具有巨大经济效益，转基因作物仍在生物安全和生态兼容性方面存在着争议，包括它们对植物内生微生物的影响。土壤中的一些微生物群落通过植物根际可能会进入植物的根、茎及叶片，成为内生微生物。植物内生细菌能够在健康植物组织和器官内定殖生活，但对植物不造成实质性的伤害，与植物形成互相约束、互惠互利的关系，在促进植物生长和防治植物病害方面发挥着重要作用，大多数高等植物中普遍存在内生细菌。例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)通过分泌各种代谢产物，促进植物生长，并控制植物疾病。枯草芽孢杆菌B-916成功地控制了江苏省水稻稻曲病和纹枯病。植物内生细菌能与植物形成长期的合作关系，这从一定层面上可以说明内生细菌在植物中占据稳定的生态位，容易定殖植物体内的各个组织内部。但随着转基因植物的使用增加时，植株内外源物质的产生是否直接或间接地影响内生菌产生拮抗物质从而削弱其生防作用有待商榷，因此有必要进行研究以确定转基因植物是否会影响到植物内生微生物的生物量。在转基因棉花环境安全性评价方面，环境微生物评价一直是一个研究热点，由于微生物种类多、数量大、个体小、繁殖快，且对于环境因素的改变极其敏感，能够很好地指示生态环境的细微变化，是一种理想的监测转基因作物对生态环境影响的指标。然而文献报道的接入内生菌实验中，所用内生菌浓度影响了含菌量的检测，同时现有技术中的植物内生可培养细菌的分离方法通常采用清洗-剪切分段-分段消毒-组织捣碎-组织液涂布培养，在较长的消毒过程中消毒液很容易通过截断面浸入植物组织内从而导致部分内生细菌的死亡；或者通过二次剪切将植物片段边缘过度消毒部分去除，同时采用榨汁机在预冷条件下打碎植物组织，虽然在一定程度上避免了内生细菌源的减少，但适合提取较大量的植物组织，不适用于植物样品量较少的植株内生细菌的测定。因此，为了对转基因棉的生物安全性需要进行较长时间的跟踪监测，有必要开发出一种有效地检测棉花内生细菌动态生长的研究方法，以评价转基因棉对内生微生物的影响。
技术实现思路
本专利技术之一提供了一种分离植物内生微生物的方法，其包括如下步骤：1)采集目标大小的所述植物，将所述植物的整株植株(包括根系)浸入第一消毒液中进行整体消毒，得到消毒植株；2)从所述消毒植株上获取待分离所述内生菌的部位组织；3)向放有所述组织的容器中加入含有烷基酚聚氧乙烯醚磺化琥珀酸酯的缓冲液，研磨之后得到组织研磨液；4)对所述组织研磨液中的微生物进行培养，以供后续分析。在一个具体实施方式中，在步骤1)中，所述消毒液为酸化的氯化汞水溶液。在一个具体实施方式中，在步骤1)之前还包括如下步骤：I)将所述植物的种子用内生指示菌浸泡之后播种于土壤中，出苗，使所述植物生长到目标大小(可以根据具体实验要求来确定所述植物的大小或所述植物的生长天数，这根据本领域技术常规可以确定，例如，可以为本专利技术实施例中的所述植物的子叶完全展开后的第1、7、14、21、28和35天中的至少一个阶段)，得到目标大小的所述植物。或者，在一个具体实施方式中，在步骤1)之前的步骤I)替换为：II)将所述植物的种子播种于土壤中，出苗后，用所述内生指示菌灌根(例如在所述植物的子叶完全展开后用所述内生指示菌灌根)，使所述植物生长到目标大小(可以根据具体实验要求来确定所述植物的大小或所述植物的生长天数，这根据本领域技术常规可以确定，例如，可以为本专利技术实施例中的灌根后的第1、7、14、21、28和35天中的至少一个阶段)，得到目标大小的所述植物。在一个具体实施方式中，所述内生指示菌的浓度为1×109至1×1010cfu/mL。在一个具体实施方式中，所述内生指示菌含有荧光蛋白标记基因和/或抗生素标记基因。在一个具体实施方式中，在播种之前，将所述土壤灭菌。在一个具体实施方式中，在所述种子用所述内生指示菌浸泡之前，将所述种子先后浸泡入第二消毒液和第三消毒液中做消毒处理。在一个具体实施方式中，所述第一消毒液和所述第二消毒液独立地为酸化的氯化汞水溶液，所述第三消毒液为乙醇消毒液。在一个具体实施方式中，所述第三消毒液为75％(v/v)的乙醇消毒液。在一个具体实施方式中，所述酸化的氯化汞水溶液中的氯化汞的质量浓度为0.05％至0.2％，其中，所述酸化的氯化汞水溶液经盐酸酸化，以36wt％的盐酸的体积计，所述盐酸(即36wt％的盐酸)在所述酸化的氯化汞水溶液中的体积浓度为20‰至30‰。例如，所述酸化的氯化汞水溶液中的氯化汞的质量浓度为0.1wt％；所述盐酸在所述酸化的氯化汞水溶液中的体积浓度为25‰(即1L酸化的氯化汞水溶液中含有25mL的36wt％的盐酸)。在一个具体实施方式中，在步骤1)，将所述植物的整株植株从土中移出，用无菌水冲去根部的附着土，将所述整株植株浸入所述消毒液中，8-12分钟之后将所述整株植株从消毒液中取出，接着用无菌水冲淋，从而得到所述消毒植株。在一个具体实施方式中，以所述缓冲液的总质量计作100％，所述烷基酚聚氧乙烯醚磺化琥珀酸酯的含量为0.5％至1.5％；所述缓冲液的pH值为7.2至7.6。在一个具体实施方式中，所述缓冲液为PBS缓冲液。在一个具体实施方式中，在步骤3)中，向放有所述组织的容器中加入所述缓冲液之后在研磨之前加入液氮预冷。在一个具体实施方式中，所述容器为组织研磨器。在一个具体实施方式中，研磨时间为5至10分钟。在一个具体实施方式中，在步骤4)中，将所述组织研磨液系列稀释之后，将各梯度的稀释液涂布于固体微生物培养基中培养。在一个具体实施方式中，所述后续分析包括所述微生物的菌落计数和/或所述微生物的种类鉴定。在一个具体实施方式中，所述植物为棉花、玉米和小麦中的至少一种。本专利技术之二提供了本专利技术之一中任意一项所述的方法在评价转基因植物对其内生微生物影响中的应用。在一个具体实施方式中，本专利技术之一中任意一项所述的方法在评价转基因植物在苗期对其内生微生物影响中的应用。本专利技术的有益效果：1、植物种子浸种及灌根处理的内生指示菌浓度为用1×109至1×1010cfu/mL，可以保证内生指示菌一定时间内在植物植株的不同组织具有可检测到的含菌量。2、植株采用整株消毒，无菌水充分淋洗后再进行组织分段，最大限度的保留了更多的内生菌源。3、组织研磨液采用含有烷基酚聚氧乙烯醚磺化琥珀酸酯的PBS缓冲液(对内生菌的富集效果明显。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明，但本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离植物内生微生物的方法，其包括如下步骤：/n1)采集目标大小的所述植物，将所述植物的整株植株浸入第一消毒液中进行整体消毒，得到消毒植株；/n2)从所述消毒植株上获取待分离所述内生菌的部位组织；/n3)向放有所述组织的容器中加入含有烷基酚聚氧乙烯醚磺化琥珀酸酯的缓冲液，研磨之后得到组织研磨液；/n4)对所述组织研磨液中的微生物进行培养，以供后续分析。/n

【技术特征摘要】
1.一种分离植物内生微生物的方法，其包括如下步骤：
1)采集目标大小的所述植物，将所述植物的整株植株浸入第一消毒液中进行整体消毒，得到消毒植株；
2)从所述消毒植株上获取待分离所述内生菌的部位组织；
3)向放有所述组织的容器中加入含有烷基酚聚氧乙烯醚磺化琥珀酸酯的缓冲液，研磨之后得到组织研磨液；
4)对所述组织研磨液中的微生物进行培养，以供后续分析。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)之前还包括如下步骤：
I)将所述植物的种子用内生指示菌浸泡之后播种于土壤中，出苗，使所述植物生长到目标大小，得到目标大小的所述植物；
在步骤1)之前的步骤I)替换为：
II)将所述植物的种子播种于土壤中，出苗后用所述内生指示菌灌根，使所述植物生长到目标大小，得到目标大小的所述植物；
优选地，所述内生指示菌的浓度为1×109至1×1010cfu/mL；
优选地，所述内生指示菌含有荧光蛋白标记基因和/或抗生素标记基因；
优选地，在播种之前，将所述土壤灭菌；
优选地，在所述种子用所述内生指示菌浸泡之前，将所述种子先后浸泡入第二消毒液和第三消毒液中做消毒处理。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述第一消毒液和所述第二消毒液独立地为酸化的氯化汞水溶液，所述第三消毒液为乙醇消毒液；
优选地所述第三消毒液为75％(v/v)的乙醇消毒液；
优选地，所述酸化的氯化汞水溶液中的氯化汞的质量浓度为0.05％至0.2％，其中，所述酸化的氯化汞水溶液经盐酸酸化，以36wt％的盐酸的体积计，...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹伟平，杜立新，宋健，郭庆港，鹿秀云，
申请(专利权)人：河北省农林科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：河北;13