一种敏感的β‑淀粉样蛋白(Aβ)纳米荧光探针的制备方法及应用。该探针的构建基于温度响应性的复合胶束，并在疏水微区上接入能够与Aβ蛋白特异性结合的GLVFF短肽以提高复合胶束对Aβ的选择性结合能力，同时接入可与氨基反应的荧光分子——对硝基苯基活性酯修饰的低聚(对苯乙烯撑)衍生物(OPV‑NP)荧光基团来实现复合胶束捕获Aβ前后荧光信号的改变，从而实现对溶液中(例如脑脊液)Aβ蛋白含量的检测。本发明专利技术的制备方法简单，无毒，检测方法简便易行，易于操作，耗时短，成本低，提高了检测的安全性和工作效率。该发明专利技术检测效果灵敏，对Aβ具有特异性，为低浓度Aβ蛋白的体外检测提供了新的思路，在阿尔兹海默症的早期诊断上具有广泛的应用前景。
Preparation and application of a sensitive fluorescent probe for \u03b2 - amyloid
【技术实现步骤摘要】
一种敏感的β-淀粉样蛋白纳米荧光探针的制备方法及应用
本专利技术属于纳米生物医药材料领域，利用复合壳层胶束化学修饰可靶向Aβ的GLVFF多肽，同时结合具有氨基响应性的对硝基苯基活性酯修饰的低聚(对苯乙烯撑)衍生物(OPV-NP)荧光分子，开发制备了一种高灵敏性的低成本Aβ荧光探针，用于Aβ蛋白的体外检测。
技术介绍
阿尔兹海默症(Alzheimer’sdisease,AD)，又称老年痴呆症，是老年人最常见的神经退行性疾病之一。该疾病的发展伴随着记忆的逐渐丧失和认知能力的损伤。在AD晚期，难以挽回的病理损伤已经形成，其治疗效果十分有限。因此，尽早诊断、尽早治疗是治疗AD的最好途径。然而目前常用的方法，如：脑部成像(PET，CT等)，神经心理学，认知和神经学测试等的诊断主要基于疾病中晚期大脑发生的病理变化和认知能力的改变，难以适应早期诊断的需要。不同于大脑的器质性病理变化和认知损伤，存在于体液中的AD生物标志物，β-淀粉样蛋白(Aβ)的含量在AD早期就已经发生明显变化。因此，检测脑脊液中Aβ的含量能够及时有效地进行AD的早期诊断，从而有利于AD的早期治疗。目前针对体液中Aβ的检测方法主要为酶联免疫吸附法(ELISA)。尽管ELISA有着较好的特异性检测能力，但是其操作复杂，检测时间长，用于Aβ识别的酶联抗体的价格十分昂贵，而且其用于化学发光检测的基质具有致癌性，使其应用受到限制，迫切需要寻找一种替代方法。纳米粒子拥有复杂多变的表面结构和可修饰性，通过设计具有适当功能的纳米粒子，可以实现特定的需求，是开发新型Aβ蛋白探针的良好选择。
技术实现思路
为提高对低浓度Aβ的检测的灵敏度，便捷度和安全性，本专利技术提供了一种敏感的β-淀粉样蛋白纳米荧光探针的制备方法及应用，为低浓度Aβ蛋白的体外检测提供一种简便、安全、经济的新方法。本专利技术利用温度响应性两嵌段聚合物与两亲性嵌段聚合物自组装得到具有表面相分离结构的核-壳-冠结构复合胶束，并在其疏水微区部分化学修饰了LVFF短肽和对硝基苯基活性酯功能化的低聚(对苯乙烯撑)衍生物(OPV-NP)。利用胶束表面疏水微区与亲水链段组成的空腔，捕获Aβ蛋白至疏水微区，同时阻止部分大体积蛋白的进入和干扰。OPV-NP分子上的对硝基苯基活性酯的拉电子作用使其骨架三聚苯乙炔的荧光淬灭。其在疏水微区的引入可以与复合胶束吸附的Aβ蛋白赖氨酸残基的氨基发生反应，通过亲和取代替代对硝基苯基活性酯，导致荧光增强，从而使复合胶束具有荧光探针的功能。LVFF短肽是Aβ蛋白的疏水核心，能够特异性地与Aβ蛋白结合并抑制Aβ聚集。其引入可以进一步提高探针对Aβ蛋白的选择性结合能力，阻止小分子蛋白与OPV-NP分子的反应。该探针避免了传统ELISA方法中昂贵酶联抗体和有毒基质的使用，降低了成本，提高了安全性和工作效率。该纳米探针能够实现对低浓度Aβ蛋白灵敏且特异性的检测，为Aβ的体外检测和阿尔兹海默症的早期诊断提供了新的思路。本专利技术的技术方案一种敏感的β-淀粉样蛋白纳米荧光探针，在温度响应性两嵌段聚合物的响应性链段末端引入能够与Aβ特异性结合的GLVFF短肽，以及能够与Aβ上蛋白氨基反应的具有氨基响应性的荧光分子——对硝基苯基活性酯功能化的低聚(对苯乙烯撑)衍生物(OPV-NP)，然后再通过与两亲性嵌段聚合物的自组装，得到能够敏感且特异性检测低浓度Aβ含量的核-壳-冠结构复合胶束作为Aβ纳米荧光探针。一种敏感的β-淀粉样蛋白纳米荧光探针的制备方法，具体方法如下：1)两亲性嵌段聚合物聚环己内酯-b-聚乙二醇(PCL-b-PEG)的合成在辛酸亚锡的催化下，通过端羟基聚乙二醇(PEG-OH)引发ε-己内酯(ε-CL)开环聚合(ROP)得到PCL-b-PEG两亲性嵌段聚合物。2)聚环己内酯-三硫代碳酸酯(PCL-TTC)大分子链转移剂的合成利用丙烯酸羟乙酯(HEA)引发ε-CL开环聚合(ROP)得到聚环己内酯(PCL-OH)；将链转移剂2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸(DDMAT)经过酰氯化后与PCL-OH反应，得到大分子链转移剂PCL-TTC。3)温度响应性两嵌段聚合物聚环己内酯-b-聚N-异丙基丙烯酰胺(PCL-b-PNIPAM)的合成将步骤2)得到的PCL-TTC和N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)单体混合，通过可逆加成-断裂链转移自由基聚合(RAFT)合成PCL-b-PNIPAM。4)PCL-b-PNIPAM-APM的合成将N-(2-氨基乙基)丙烯酰胺盐酸盐(APM)单体与步骤3)合成的PCL-b-PNIPAM混合，通过RAFT聚合合成PCL-b-PNIPAM-APM。5)PCL-b-PNIPAM-GLVFF的合成利用正己胺和二甲基苯基磷将步骤3)合成的PCL-b-PNIPAM端基的三硫酯键还原为巯基，加入丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)，并通过巯基-双键的点击反应得到PCL-b-PNIPAM-NHS。随后与GLVFF上的氨基反应，纯水透析后，真空冷冻干燥得到PCL-b-PNIPAM-GLVFF。6)Aβ纳米荧光探针的制备将步骤1)合成的PCL-b-PEG、步骤5)合成的PCL-b-PNIPAM-GLVFF与步骤4)合成的PCL-b-PNIPAM-APM按照2:1:1的摩尔比溶解在DMF中。加入OPV-NP，其与聚合物中APM的摩尔比大于1:1，37℃下震荡孵育0.5-2h。在电磁搅拌下逐滴滴入4℃纯水中，搅拌过夜，PBS透析后得到粒径40-300nm且分布均匀的复合胶束，在37℃下孵育后即为Aβ纳米荧光探针。本专利技术所述Aβ纳米荧光探针能够用于特异性检测溶液中的Aβ——Aβ纳米荧光探针对Aβ检测的特异性；具体步骤如下：使用人工脑脊液(ACSF)配置Aβ蛋白等多种蛋白溶液[如牛血清蛋白(BSA)，泛素蛋白(ubiquitin)等]。将Aβ纳米荧光探针置于37℃下孵育后，分别加入等质量浓度的上述蛋白(如BSA、ubiquitin和Aβ三种蛋白)溶液，继续在37℃下恒温震荡30min。利用荧光分光光度计检测体系的荧光变化，记录相应荧光光谱和最大发射波长处的荧光强度。发现BSA和ubiquitin对体系荧光无影响，而加入Aβ蛋白后体系荧光明显增强。本专利技术所述Aβ纳米荧光探针能够定量检测溶液中Aβ的含量——Aβ纳米荧光探针对Aβ蛋白的检测能力；具体步骤如下：1)建立Aβ浓度—荧光强度的标准曲线；将Aβ纳米荧光探针置于37℃下孵育后，分别与不同浓度的Aβ蛋白样品溶液混合，继续在37℃下恒温震荡30min。在相同条件下检测混合液样品的荧光，记录相应荧光光谱和最大发射波长处的荧光强度，得到Aβ浓度与荧光光强的标准曲线。2)Aβ的含量检测；按照步骤1)方法检测待测样品与纳米荧光探针混合液的荧光强度，通过步骤1)中建立的Aβ浓度—荧光强度标准曲线即可得到Aβ的含量。本专利技术所述Aβ纳米荧光探针的应用能够检测大鼠脑脊液中Aβ含量，具体步骤是：取本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种敏感的β-淀粉样蛋白(Aβ)纳米荧光探针，其特征在于：在温度响应性两嵌段聚合物的响应性链段末端引入能够与Aβ特异性结合的GLVFF短肽，以及能够与Aβ蛋白氨基反应的具有氨基响应性的荧光分子——对硝基苯基活性酯功能化的低聚(对苯乙烯撑)衍生物(OPV-NP)，然后再通过与两亲性嵌段聚合物的自组装，得到能够敏感且特异性检测Aβ含量的核-壳-冠结构复合胶束作为Aβ纳米荧光探针。/n
【技术特征摘要】
1.一种敏感的β-淀粉样蛋白(Aβ)纳米荧光探针，其特征在于：在温度响应性两嵌段聚合物的响应性链段末端引入能够与Aβ特异性结合的GLVFF短肽，以及能够与Aβ蛋白氨基反应的具有氨基响应性的荧光分子——对硝基苯基活性酯功能化的低聚(对苯乙烯撑)衍生物(OPV-NP)，然后再通过与两亲性嵌段聚合物的自组装，得到能够敏感且特异性检测Aβ含量的核-壳-冠结构复合胶束作为Aβ纳米荧光探针。
2.一种权利要求1所述的Aβ纳米荧光探针的制备方法，其特征在于步骤如下：
1)两亲性嵌段聚合物聚环己内酯-b-聚乙二醇(PCL-b-PEG)的合成
在辛酸亚锡的催化下，通过端羟基聚乙二醇(PEG-OH)引发的ε-己内酯(ε-CL)开环聚合(ROP)得到PCL-b-PEG两亲性嵌段聚合物；
2)聚环己内酯-三硫代碳酸酯(PCL-TTC)大分子链转移剂的合成
利用丙烯酸羟乙酯(HEA)引发ε-CL开环聚合(ROP)得到聚环己内酯(PCL-OH)；将链转移剂2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸(DDMAT)经过酰氯化后与PCL-OH反应，得到大分子链转移剂PCL-TTC；
3)温度响应性两嵌段聚合物聚环己内酯-b-聚N-异丙基丙烯酰胺(PCL-b-PNIPAM)的合成
将步骤2)得到的PCL-TTC和N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)单体混合，通过可逆加成-断裂链转移自由基聚合(RAFT)得到PCL-b-PNIPAM；
4)PCL-b-PNIPAM-APM的合成
将N-(2-氨基乙基)丙烯酰胺盐酸盐(APM)单体与步骤3)合成的PCL-b-PNIPAM混合，通过RAFT聚合合成PCL-b-PNIP...
【专利技术属性】
技术研发人员：史林启，杨惠茹，黄帆，马如江，安英丽，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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