一种可视化检测MCR-3多粘菌素耐药基因的引物组及其检测方法技术

本发明专利技术提供了一种可视化检测MCR‑3多粘菌素耐药基因的引物组及其检测方法，属于细菌耐药基因的检测领域。其技术方案为：引物组包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP；在62℃对DNA样品进行LAMP扩增反应，在LAMP反应体系中预先添加适量羟基萘酚兰(HNB)，通过观察反应液的颜色变化判断待测物中是否存在MCR‑3基因。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术能够在恒温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地检测到MCR‑3基因，无需昂贵复杂的仪器，为细菌耐药基因的检测提供了新的方法，具有较大的应用价值。

A visual primer set and its detection method for the detection of multidrug resistance gene of mcr-3

【技术实现步骤摘要】
一种可视化检测MCR-3多粘菌素耐药基因的引物组及其检测方法
本专利技术涉及一种细菌耐药基因的检测领域，尤其涉及一种可视化检测MCR-3多粘菌素耐药基因的引物组及其检测方法。
技术介绍
自20世纪20年代开始，大量天然抗生素相继被发现，开启了抗生素时代，但随着对抗生素使用的过度依赖，细菌抗药问题日益凸显。耐药性细菌使得抗生素药物效减弱、甚至失效。多粘菌素(Polymyxins)是多粘杆菌培养液中提得的一组多肽类抗生素，有5种成分(A,B,C,D,E)。临床常用的是多粘菌素(PolymyxinB)和多粘菌素E(colislin,抗敌素)。多粘菌素被认为是人类抗击细菌的最后防线；近几年来，质粒介导的多粘菌素耐药基因mcr的快速进化及其在全球范围内的广泛传播，给公共卫生和人类健康造成了严重威胁，从而一个新的可移动粘菌素耐药基因MCR-3，自从在中国山东首次发现以来，已在多个国家的重症患者所携带的多重耐药的肠道细菌中大量检出，并且在全国13个省份中的8个省份发现了MCR-3阳性菌；由于MCR-3的广泛存在，特别是在健康人群和动物性食品中的存在，使得针对MCR检测现用的选择性筛菌、质谱鉴定菌种、药敏检测和普通PCR验证的检测程序方法变得十分繁复且低效。且需要昂贵的仪器设备等不同的原因未能在临床上大规模推广使用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够在恒温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地检测到MCR-3基因，无需昂贵复杂的仪器，为细菌耐药基因的检测提供了新的方法，具有较大的应用价值的可视化检测MCR-3多粘菌素耐药基因的引物组及其检测方法。本专利技术是通过如下措施实现的：一种可视化检测MCR-3多粘菌素耐药基因的引物组及其检测方法，其特征在于，所述引物组包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP；所述引物组中各引物的核苷酸序列分别如下所示：所述外引物F3：CAACACCATCCGCTACAC；所述外引物B3：TCCAGGTGACATCCACAC；所述内引物FIP：AGCAACGCGGTGTTGTACTTGATTGGAGAGATGATTGCCA；所述内引物BIP：CATGGTGAATCACTGGGAGCATTAAGGAACACGGGTCTGATC；所述内引物和所述外引物，通过从美国基因数据库检索获得mcr-3基因序列，并通过BLAST软件进行同源性分析，获得mcr-3基因的特异性保守靶序列，再根据该保守靶DNA序列，用软件PrimerdesignV4设计用于对mcr-3基因进行LAMP检测的引物；所述检测方法包括以下步骤：S1、提取待测样品的DNA；S2、以步骤S1中提取的基因组DNA为模板，在所述引物组的引导下进行等温LAMP扩增反应，在LAMP反应体系中预先添加适量羟基萘酚兰(HNB)；S3、结果判定：根据步骤S2中的反应液的颜色变化判断结果，天蓝色表示待测样品中存在MCR-3基因，紫色表示待测样品中不存在MCR-3基因。本专利技术的具体特点还有：所述引物组还包括将所述外引物F3、所述外引物B3、所述内引物FIP和所述内引物BIP的引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与上述序列具有相同功能的DNA分子。所述步骤2中的LAMP扩增反应的25ul反应体系含有：待测物的基因组DNA1μl、0.8M甜菜碱(betaine)、180μmol/L羟基萘酚兰、8mMMgSO4、1.4mMdNTPeach、8UBstDNApolymerase、所述内引物各0.2μM和所述外引物各1.6μM，用灭菌去离子水补齐到25µl。所述步骤S2中的LAMP扩增反应条件为：62℃恒温60min。本专利技术的有益效果为：本专利技术能够在恒温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地检测到MCR-3基因，无需昂贵复杂的仪器，为细菌耐药基因的检测提供了新的方法，具有较大的应用价值；其中，高特异性：4条引物对mcr-3基因靶序列的6个特异区域的识别保证了LAMP扩增的高度特异性，即LAMP能从相差仅一个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增；高灵敏度：灵敏度比普通PCR高10倍；结果鉴定简便：可通过肉眼观察结果(HNB显色)；操作简单：只要将检测样品和检测试剂一起放入62℃恒温水浴锅中60分钟后就可以判断结果；快速、高效扩增：整个LAMP扩增反应一小时即可完成。附图说明图1为本专利技术实施例实验一中LAMP检测结果。图2为本专利技术实施例实验一中电泳判定LAMP检测结果。图3为本专利技术实施例中实验三LAMP检测方法的特异性检测结果。图4为本专利技术实施例中实验三电泳判定LAMP检测的特异性检测结果。图5(A)为本专利技术实施例中实验三LAMP检测方法的灵敏度检测结果。图5(B)为本专利技术实施例中实验三LAMP检测方法的灵敏度检测结果。具体实施方式为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。一种可视化检测MCR-3多粘菌素耐药基因的引物组及其检测方法，其特征在于，引物组包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP；引物组中各引物的核苷酸序列分别如下所示：外引物F3：CAACACCATCCGCTACAC；外引物B3：TCCAGGTGACATCCACAC；内引物FIP：AGCAACGCGGTGTTGTACTTGATTGGAGAGATGATTGCCA；内引物BIP：CATGGTGAATCACTGGGAGCATTAAGGAACACGGGTCTGATC；内引物和外引物，通过从美国基因数据库检索获得mcr-3基因序列，并通过BLAST软件进行同源性分析，获得mcr-3基因的特异性保守靶序列，再根据该保守靶DNA序列，用软件PrimerdesignV4设计用于对mcr-3基因进行LAMP检测的引物；检测方法包括以下步骤：S1、提取待测样品的DNA；S2、以步骤S1中提取的基因组DNA为模板，在所述引物组的引导下进行等温LAMP扩增反应，在LAMP反应体系中预先添加适量羟基萘酚兰(HNB)，并将反应液放置在水浴加热锅中；S3、结果判定：根据步骤S2中的反应液的颜色变化判断结果，天蓝色表示待测样品中存在MCR-3基因，紫色表示待测样品中不存在MCR-3基因。本专利技术的具体特点还有：引物组还包括将外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP的引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与上述序列具有相同功能的DNA分子。步骤2中的LAMP扩增反应的25ul反应体系含有：待测物的基因组DNA1μl、0.8M甜菜碱(betaine)、180μmol/L羟基萘酚兰、8mMMgSO4、1.4mMdNTPeach、8UBstDNApolymerase、内引物各0.2μM和外引物各1.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可视化检测MCR-3多粘菌素耐药基因的引物组及其检测方法，其特征在于，所述引物组包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP；/n所述引物组中各引物的核苷酸序列分别如下所示：/n所述外引物F3：CAACACCATCCGCTACAC；/n所述外引物B3：TCCAGGTGACATCCACAC；/n所述内引物FIP：AGCAACGCGGTGTTGTACTTGATTGGAGAGATGATTGCCA；/n所述内引物BIP：CATGGTGAATCACTGGGAGCATTAAGGAACACGGGTCTGATC；/n所述检测方法包括以下步骤：/nS1、提取待测样品的DNA；/nS2、以步骤S1中提取的基因组DNA为模板，在所述引物组的引导下进行等温LAMP 扩增反应，在LAMP反应体系中预先添加适量羟基萘酚兰(HNB)；/nS3、结果判定：根据步骤S2中的反应液的颜色变化判断结果，天蓝色表示待测样品中存在MCR-3基因，紫色表示待测样品中不存在MCR-3基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种可视化检测MCR-3多粘菌素耐药基因的引物组及其检测方法，其特征在于，所述引物组包括外引物F3和B3，内引物FIP和BIP；
所述引物组中各引物的核苷酸序列分别如下所示：
所述外引物F3：CAACACCATCCGCTACAC；
所述外引物B3：TCCAGGTGACATCCACAC；
所述内引物FIP：AGCAACGCGGTGTTGTACTTGATTGGAGAGATGATTGCCA；
所述内引物BIP：CATGGTGAATCACTGGGAGCATTAAGGAACACGGGTCTGATC；
所述检测方法包括以下步骤：
S1、提取待测样品的DNA；
S2、以步骤S1中提取的基因组DNA为模板，在所述引物组的引导下进行等温LAMP扩增反应，在LAMP反应体系中预先添加适量羟基萘酚兰(HNB)；
S3、结果判定：根据步骤S2中的反应液的颜色变化判断结果，天蓝色表示待测样品中存在MCR-3基因，紫色表示待测样...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝智慧，刘志海，郭长梅，黄亭亭，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37