快速按需的肝素诱导血小板减少症功能测定制造技术

测定患者血清或血浆样品中肝素诱导的血小板减少症(HIT)的方法，该方法包括：在低浓度肝素或高浓度肝素存在下，将血小板与患者血清或血浆样品的混合物孵育；在存在或不存在血小板活化剂的情况下孵育血小板混合物；将混合物中的血小板和活化血小板进行定量；计算每种混合物中血小板内活化血小板的百分比；用计算的百分比计算肝素血小板活化(HEPLA)指数；测量和计算未患HIT的供体血清或血浆样品的HEPLA指数；根据未患HIT的供体的血清或血浆样品的HEPLA指数来计算截止值，并通过比较患者的HEPLA指数和截止值来确定患者是否患有HIT。

Rapid and on-demand heparin induced thrombocytopenia

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】快速按需的肝素诱导血小板减少症功能测定相关申请的交叉引用本申请要求2017年3月29日提交的美国临时专利申请No.62/478,105的优先权，其全部内容通过引用整体并入本文。
本主题涉及诊断测定。更具体地，本主题涉及肝素诱导的血小板减少症测定。
技术介绍
肝素诱导的血小板减少症，也称为HIT，是一种促血栓形成和潜在致命的医源性疾病，大约5-10％的患者接触肝素而发生这种病症(BellWR，T.P.，1976，Thrombocytopeniaoccuringduringtheadministrationofheparin:Aprospectivestudyin52patients(肝素给药期间发生血小板减少症：一项在52名患者中的前瞻性研究)，AnnalsofInternalMedicine(内科医学年鉴)，155-160；KingDJ，K.J.，1984，Heparinassociatedthrombocytopenia(肝素相关的血小板减少症)，AnnalsofInternalMedicine(内科医学年鉴)，535；DryjskiM，D.H.，1996，Heparininducedthrombocytopenia(肝素诱导的血小板减少症)，Europeanjournalofvascularandendovascularsurgery(欧洲血管和血管内外科杂志，260-269)。HIT涉及由于抗凝血剂肝素的给药而引起的血小板减少症，即低血小板计数。HIT倾向于血栓形成，即血管内血栓的异常形成，因为血小板释放激活凝血酶的微粒，从而导致血栓形成。当确定血栓形成时，该病症被称为“肝素诱导的血小板减少症和血栓形成，也称为HITT。HIT是由激活血小板的抗体的形成引起的，例如针对肝素与血小板因子4(PF4)的复合物的抗体。接受肝素治疗的患有HIT的患者可能会出现新的血栓形成，或者该患者已经存在的血栓形成可能会恶化，或者患者的血小板计数可能会下降。因为患者患血栓形成事件的风险很高，约有30-50％的患者在HIT诊断时发生静脉和/或动脉血栓形成(KeltonJG，1986，Heparin-inducedThrombocytopenia.Haemostasis，173-186)，停止给予肝素，并且在诊断证实之前推测患者转为替代抗凝治疗。II型HIT是HIT的最严重形式，其通过循环免疫球蛋白G(IgG)抗体介导，所述抗体在药理学浓度下靶向PF4和肝素(H)的复合物。IgG：PF4：H复合物通过FcΥRII受体结合并激活血小板，导致凝血酶生成和血小板聚集(VisentinGP，F.S.，1994，AntibodiesfromPatientswithHeparin-inducedThrombocytopenia/ThrombosisAreSpecificforPlateletFactor4ComplexedwithHeparinorBoundtoEndothelialCells.Journalofclinicalinvestigation，81-88)。由于血栓形成事件在HIT患者中很常见，因此快速可靠的诊断，允许立即转换为替代抗凝血剂是至关重要的。目前推荐的HIT诊断算法用于血小板计数在肝素给药后5-14天内下降超过50％(<50,000/mm3)的患者，其使用通过使用敏感免疫测定支持的4Ts评分估计临床概率，用于初步筛查HIT患者，以指导HIT阳性患者的初始治疗。用于初始检测HIT患者的示例性筛选免疫测定是肝素-PF4-ELISA，即肝素-PF4-酶联免疫吸附测定。该筛选免疫测定旨在检测针对肝素-PF4复合物的抗体。然而，肝素-PF4-ELISA检测到所有与肝素-PF4复合物结合的循环抗体，并且还可能错误地检测到不会引起HIT的抗体。因此，即使免疫测定是高度敏感的，它也缺乏特异性。因此，在筛选免疫测定中发现阳性的那些进一步用确认更具体的功能测定进行测试。其他功能性HIT测定法测试患者的血清或血浆样品在肝素存在下引起血小板聚集的能力。此类测定的实例是：光透射聚集测定法(LTA)，肝素诱导的多电极聚集测定法(HIMEA)和肝素诱导的血小板活化(HIPA)。例如，在HIPA中，在肝素存在下，将来自受试患者的血清与来自供体的血小板混合。供体血小板的凝集表明在受试患者的血清中存在针对PF4-肝素的抗体。可获得几种功能性HIT测定，例如金标准14C-血清素释放测定(SRA)。该测试使用来自几个供体的血小板和来自受试患者的血清。将血小板加载14C-血清素，洗涤并与血清和肝素混合。然后测试样品中血清素的释放，血清素的释放是血小板活化的标志。如果SRA显示高血清素释放，则确认HIT的诊断。由于它们的复杂性，上述用于诊断HIT的测试在远程参考实验室进行。它们非常耗时，因为它们需要批量处理。换句话说，不可能按需对个体患者进行这些测试。结果，这些现有技术测试定期进行，例如每月进行。这种情况的结果是测试结果可以延迟几周。因此，当需要快速回答重症护理决策时，例如在心脏外科手术期间，或在体外膜氧合(ECMO)过程期间，用于诊断HIT的现有技术测试不适用于紧急情况。这种情况的一个结果是，在获得测试结果之前，患者可能已经得到错误的治疗，这可能是有害的，甚至是致命的。此外，由于在医生检查时缺乏检测结果，可疑的HP患者可能会接受比肝素贵100-200倍的替代抗凝剂，或者比肝素更难处理，或与出血事件有关。现有技术HIT测定的另一个缺点是它们需要使用供体血小板与所检查患者的血浆或血清样品一起孵育。其原因是由于患者出血和测试本身之间的长时间段而不能使用患者自己的血小板。此外，现有技术的HIT测定与HIT的生理病理学不完全一致。在HIT中，血小板活化是由抗肝素-PF4复合物抗体的恒定片段(Fc)与血小板膜Fc受体(FcγRIIa)-免疫球蛋白G(IgG)的Fc的低亲和力受体结合引起的，也见于中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞。然而，存在Fc受体的多态性，并且受体结构甚至可能比肝素诱导的血小板活化的抗体浓度更重要。因此，如果供体的血小板具有与患者的血小板不同的态射，则可能潜在地产生诊断偏差，从而导致较低的准确性和相应的误诊。现有技术HIT测定的另一个缺点涉及测定中使用的血小板。基于这些血小板被抗肝素-PF4抗体充分活化的知识，一些现有技术的HIT测定是用从供体收集的血小板进行的。通常，血小板供体是实验室工作人员。这引发了道德问题和方法问题。关于道德问题，在一些国家，例如比利时，禁止从实验室人员抽血用于实验室进行诊断测定的做法。方法问题涉及实验室工作人员不能定期反复捐献血小板的事实。此外，它们在任何时候都不可用，例如在实验室人员的工作时间之后需要进行紧急检测时。另一种方法是，在某些测定中，例如SRA，需要洗涤供体的血小板。这在测定过程中增加了一个步骤，并且添加可能在它们暴露于受试患者的血清或血浆样品之前无意中活化血小板。此外，由于获得现有技术测定的结果之前要经过很长时间，例如SRA和HIPA，几本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.测定患者血清或血浆样品中肝素诱导的血小板减少症(HIT)的方法，该方法包括：/n在低浓度肝素(患者低肝素混合物)或高浓度肝素(患者高肝素混合物)存在的情况下，将血小板与患者的血清或血浆样品一起孵育；/n在血小板活化剂存在下(阳性对照混合物)或不存在(阴性对照混合物)的情况下孵育血小板；/n对患者低肝素混合物、患者高肝素混合物、阳性对照混合物和阴性对照混合物中的血小板和活化血小板进行定量；/n计算每种上述混合物中血小板内活化血小板的百分比，并获得以下值：/n患者低肝素混合物中活化血小板的百分比[％R(低)]；/n患者高肝素混合物中活化血小板的百分比[％R(高)]；/n阳性对照混合物中活化血小板的百分比[％R(Ct+)]，以及/n阴性对照混合物中活化血小板的百分比[％R(Ct-)]；/n通过将％R(低)和％R(高)之间的差值除以％R(Ct+)和％R(Ct-)之间的差值并将得到的商乘以100来计算肝素血小板活化(HEPLA)指数；/n测量和计算来自未患HIT的供体的血清或血浆样品的HEPLA指数；/n根据来自未患HIT的供体的血清或血浆样品的HEPLA指数来计算截止值，并且/n通过比较患者的HEPLA指数和截止值来确定患者是否患有HIT。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170329 US 62/478,1051.测定患者血清或血浆样品中肝素诱导的血小板减少症(HIT)的方法，该方法包括：
在低浓度肝素(患者低肝素混合物)或高浓度肝素(患者高肝素混合物)存在的情况下，将血小板与患者的血清或血浆样品一起孵育；
在血小板活化剂存在下(阳性对照混合物)或不存在(阴性对照混合物)的情况下孵育血小板；
对患者低肝素混合物、患者高肝素混合物、阳性对照混合物和阴性对照混合物中的血小板和活化血小板进行定量；
计算每种上述混合物中血小板内活化血小板的百分比，并获得以下值：
患者低肝素混合物中活化血小板的百分比[％R(低)]；
患者高肝素混合物中活化血小板的百分比[％R(高)]；
阳性对照混合物中活化血小板的百分比[％R(Ct+)]，以及
阴性对照混合物中活化血小板的百分比[％R(Ct-)]；
通过将％R(低)和％R(高)之间的差值除以％R(Ct+)和％R(Ct-)之间的差值并将得到的商乘以100来计算肝素血小板活化(HEPLA)指数；
测量和计算来自未患HIT的供体的血清或血浆样品的HEPLA指数；
根据来自未患HIT的供体的血清或血浆样品的HEPLA指数来计算截止值，并且
通过比较患者的HEPLA指数和截止值来确定患者是否患有HIT。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述血小板的孵育和所述血小板和活化的血小板的定量是一步孵育，其中
所述患者低肝素混合物包括：
从患者获得的血清或血浆样品；
含有血小板的样品；
低剂量的肝素
血小板的标记检测元件；
活化血小板的标记检测元件，和
稀释剂；
所述患者高肝素混合物包括：
从患者获得的血清或血浆样品；
含有血小板的样品
高剂量的肝素；
血小板的标记检测元件，
活化血小板的标记检测元件，和
稀释剂；
所述阳性对照混合物包括：
含有血小板的样品；
血小板活化剂；
血小板的标记检测元件；
活化血小板的标记检测元件，和
稀释剂，
并且
所述阴性对照混合物包括：
含有血小板的样品；
血小板的标记检测元件；
活化血小板的标记检测元件，和
稀释剂。


3.根据权利要求2所述的方法，其中所述血小板的定量是根据从所述血小板的标记检测元件获得的信号的水平，并且所述活化的血小板的定量是根据从活化血小板的标记检测元件获得的信号的水平。


4.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·奥卡福维，F·乔治，A·托马尔，F·阿勒曼德，
申请(专利权)人：埃莫塞斯公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR