用于实体瘤诊断的生物标志物绝对定量的方法和装置制造方法及图纸

本发明专利技术提供了一种定量分析样品的方法。该方法包括下列步骤：(a)提供代表所述样品的一个或多个特征的单个标志物，所述样品包含所述标志物的单个单位的群体；(b)用斑点印迹分析检测标志物，其定量结果是样品中标志物的单个单位的群体的绝对量，通过样品体积或样品重量来进行标准化；(c)基于标志物的定量结果获得样品的一个或多个特征的客观性测定。另外还公开了一种参考数据库以及用于诊断患者癌症的前述参考数据库的使用方法。

Absolute quantitative method and device of biomarkers for solid tumor diagnosis

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于实体瘤诊断的生物标志物绝对定量的方法和装置相关申请本申请的相关快速PCT要求基于2017年6月29日递交的美国临时专利申请62/526,425号的权益，并在此将该公开的内容通过参照而并入至本申请中。此外，2015年5月26号递交的美国专利申请14/721,205以及2017年2月15号递交的美国专利申请15/433,586公开的全部内容也通过参照而并入至本申请中。
本专利技术涉及利用免疫印迹分析方法以临床诊断为目的而对生物标志物(biomarker)在组织水平进行定量检测的方法和装置。具体而言，本专利技术涉及利用定量斑点印迹(QDB：quantitativedotblot)分析对生物标志物的表达水平进行检测并且结合参考数据库分析从而针对实体瘤提供诊断和预后的方法和装置。
技术介绍
蛋白质分析是现代生物学研究的重要基础。这项技术基于抗原-抗体相互作用的原理来测量目标抗原在各种医疗或实验条件下的表达水平。抗原被定义为当进入人体时能够触发免疫系统产生抗体的外来分子。抗体由于其针对特定抗原的高特异性，成为临床、制药和生物医学研究中一个有力的工具。抗原包括但不限于，化合物、多肽、蛋白质、RNA分子、DNA分子、细胞(在原位释放的蛋白质)或病毒颗粒(在原位释放的蛋白质)。完整或部分抗原分子，可被引入到包括驴、山羊、兔子等宿主动物体内，产生大量针对目标抗原的抗体。此外，导入的抗原或抗原的一部分，可能具有一个或几个抗原决定簇，因此，由于抗原决定簇数目的不同，宿主体内可能产生一个或多个针对目标抗原的特异性抗体。一个典型的免疫检测过程可以分为三个主要步骤。第一步是点样，将制备的含有目标抗原的样品首先转移到诸如硝酸纤维素膜、PVDF膜或像具有结合蛋白质能力的多孔板、免疫组化(IHC)中的载玻片和QDB板中的膜之类的固相载体的表面上。第二步是形成并标记目标抗原抗体复合物(例如，免疫复合物)；这一过程又包括阻塞、孵育和清洗子步骤。在阻塞子步骤，膜上的非特异性蛋白质结合位点经阻塞液(blockingbuffer)处理来避免抗体非特异性结合到膜上。在免疫组化的有些情形中，在施加阻塞液前，需要进一步处理载玻片上的组织切片(脱蜡和抗原修复)。经过阻塞后，在孵育子步骤中，膜和针对目标抗原的抗体一起孵育，从而在膜上形成抗原抗体复合物；而未与目标抗原结合的抗体在这一过程中被洗掉。这里用的抗体一般是可购买的、预先标记的抗体。当然也可以通过一个标记子步骤在原位进行标记。在任一情形下使用的抗体应该被标记，通过标记物(reporter)例如标记酶(reporterenzyme)进行直接标记，或者通过由标记物标记的第二抗体进行间接标记。第三步是检测。对标记酶发出的信号进行检测并记录，从而提供与膜结合的免疫复合物的数量或者质量相关信息。不同的标记方法也相应地需要不同的检测方法。例如，第三步的检测反应可以是通过目测的颜色变化或者是通过扫描仪、X射线胶片或酶标仪检测的化学发光信号。在检测过程中抗体也可以通过荧光进行标记，并利用扫描仪进行检测。蛋白质分析的多种技术都是这个典型的免疫检测法的变种。这些技术包括但不限于西式印迹分析技术、斑点免疫印迹分析技术、免疫组化(IHC)技术、酶联免疫分析(ELISA)技术、反向蛋白芯片(reversephaseproteinmicroarray：RPPM)技术和新开发的定量斑点印迹分析(QDB)技术和载通(Zestern)技术。在免疫组化分析中，组织块首先以石蜡包埋块或冰冻块的形式进行处理，并进而以一定的厚度切割成切片，放置于载玻片上。然后，切片经过典型的免疫检测过程处理，使检测抗体和目标抗原在载玻片上形成免疫复合物。病理学家可利用该预先标记的抗体并借助显微镜对载玻片上的目标抗原进行检测。对于来自石蜡包埋的切片，为了促进抗原抗体反应，切片需要经过进一步处理。这些处理可包括对切片进行脱蜡和抗原修复，从而露出抗原以进行抗原抗体反应。在临床实践中，出于临床诊断和预后的目的，免疫组化分析被广泛用于在蛋白质水平上检测生物标志物表达的变化。典型的生物标志物的免疫组化报告表述为“+”或“-”，或者进而分类成“0、1+、2+、3+”。例如，通过免疫组化的方法分析常用于乳腺癌诊断的生物标志物——人表皮生长因子受体2(Her2)的表达水平，以确定是否在治疗过程中包括Her2针对性疗法(Her2-dependenttherapy)。免疫组化的结果被分成四组：0和1+、2+和3+。0组和1+组的结果被认为是阴性，3+组被认为是阳性，而2+组被认为是两可。为了能有效反映染色强度与染色细胞百分比例，临床领域开发了包括H分数(H指数)的评分系统以提供关于免疫组化分析的更多详细信息。在另外的情形下，也可同时提供染色强度(例如强和弱)以及染色细胞的百分比。例如，结果可以报告为“(百分比，强度)”。然而，这些结果本质上都是半定量的结果。免疫组化提供了宝贵的形态学信息，并且人们已经投入了大量努力以实现分析程序的标准化，其结果仍然是定性的，受到包括处理过程、视野和观察者差异等因素的影响。这项技术也难以用于高通量分析。免疫组化分析相关联的不确定性导致诊断中的错误明显增加。事实上，在Her2的情况下，免疫组化分析的结果和荧光原位杂交(FISH)技术的结果相比较，不一致性(inconsistency)高达30％。免疫组化的分类结果也难以用于进一步数据分析。例如，虽然在阳性的个体患者中存在显著差异，它们在临床实践中被归结为同一类别。因而，来自免疫组化分析的结果难以用来进行充分的数据分析以提供我们所希望的更准确、更有预见性的诊断和预后。人们尝试过在组织水平定量检测生物标志物的含量并取得了成功。例如，基于亲近性分析(proximityassay)的Hermark测试，能够定量检测乳腺癌组织中的Her2表达水平。然而，这项技术检测的是乳腺癌患者中相对的Her2表达水平。同时，人们用SRM-MS质谱技术成功检测了Her2的绝对含量(绝对水平)。利用同位素标记的标准蛋白，人们检测了Her2的绝对含量，并利用受试者工作特性(ReceivingOperativeCharacteristics：ROC)分析建议了740amole/g的临界值。然而，这些方法都非常复杂、操作繁琐，不适合于大量样品的高通量分析。复杂的分析过程也显著提高了操作成本和劳力。然而，最近开发的QDB方法，显示出适合通过高通量方式处理由细胞或组织制备的复合裂解液。当引入标准蛋白时，不管以重组蛋白形式还是以纯化蛋白形式，都可以将这种方法非常方便地转化为绝对定量的方法以对某特定蛋白的含量在细胞或组织水平上进行绝对定量测定。本专利技术中，我们力图利用QDB技术在组织水平上测定生物标志物表达水平以用于临床诊断。在本专利技术一实施方式中，目前临床诊断通用的免疫组化技术可以被转化为绝对定量测试方法，该方法在准确、量化、客观、高通量以及更全面地辅助临床诊断和预后方面具有显著的优点。来自QDB分析的绝对数据能够进一步以大规模方式进行数据分析，以提本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定量分析样品的方法，其包括下列步骤：/n(a)提供代表所述样品的一个或多个特征的单个标志物，所述样品包含所述标志物的单个单位的群体；/n(b)用斑点印迹分析检测所述标志物，其定量结果是样品中所述标志物的单个单位的群体的绝对量，通过样品体积或样品重量来进行标准化；以及/n(c)基于所述标志物的定量结果获得样品的一个或多个特征的客观性测定。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170629 US 62/526,4251.一种定量分析样品的方法，其包括下列步骤：
(a)提供代表所述样品的一个或多个特征的单个标志物，所述样品包含所述标志物的单个单位的群体；
(b)用斑点印迹分析检测所述标志物，其定量结果是样品中所述标志物的单个单位的群体的绝对量，通过样品体积或样品重量来进行标准化；以及
(c)基于所述标志物的定量结果获得样品的一个或多个特征的客观性测定。


2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括：通过定量斑点印迹分析即QDB分析来检测标志物。


3.如权利要求2所述的方法，其中步骤(b)包括：
(b1)将样品与包含结合因子的溶液一起孵育，其中所述结合因子能够特异性结合所述标志物的单个单位，并且所述结合因子能够通过所述斑点印迹分析进行定量；以及
(b2)通过所述结合因子的QDB分析来检测所述标志物。


4.如权利要求3所述的方法，其中，所述标志物是蛋白标志物，且所述结合因子是抗体。


5.如权利要求4所述的方法，其中，所述抗体是分析物特异性试剂(ASR)级抗体。


6.如权利要求4所述的方法，其中，所述抗体是体外诊断(IVD)级抗体。


7.如权利要求4所述的方法，其中，所述抗体能够在免疫组织化学中进行检定。


8.如权利要求1所述的方法，其中，所述样品是来自实验对象的活检组织。


9.如权利要求8所述的方法，其中，所述活检组织是以福尔马林固定且以石蜡包埋的组织。


10.如权利要求8所述的方法，其中，所述实验对象是癌症患者。


11.如权利要求10所述的方法，其还包括步骤(d)根据标志物的定量结果来评估患者。


12.如权利要求11所述的方法，在所述步骤(d)中，所述评估患者包括对患者进行癌症的诊断和预后。

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【专利技术属性】
技术研发人员：张建棣，
申请(专利权)人：烟台康体诊医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37