一种念珠藤提取物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种念珠藤提取物及其制备方法和应用，包括以下步骤：首先取8公斤念珠藤根和茎干燥后粉碎，用乙醇浸泡2小时，超声回流提取3次，合并提取液，过滤，旋转蒸发仪减压浓缩得浸膏，浸膏以适量硅藻土拌匀，用滤纸筒严密包好后放入索氏提取器抽提筒内，在干燥的索氏提取器抽提筒加入乙酸乙酯，安装好索氏提取器，在恒温电热套中抽提6小时，提取液旋转蒸发浓缩得浸膏，浸膏采用硅胶柱层析，洗脱液旋转蒸发回收溶剂后冷冻喷雾干燥，得提取物干燥粉，本发明专利技术通过念珠藤提取物对胸腔渗出液炎症介质的准确全方位的分析。

A kind of extract of Nostoc and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种念珠藤提取物及其制备方法和应用
本专利技术是一种念珠藤提取物及其制备方法和应用，属于中药材

技术介绍
念珠藤为夹竹桃科念珠藤属植物念珠藤的干燥地上部分，为传统民间草药，在福建、浙江、广东等地民间被广泛使用。味苦,性辛温,有小毒。具祛风利湿、活血通络等功效。用于治疗风湿性关节痛，泄泻，脚气，周身浮肿，经闭，跌打损伤等症，念珠藤提取物物在不同的浓度对RAW264.7细胞24小时的毒性不清楚，现在急需一种念珠藤提取物及其制备方法和应用来解决上述出现的问题。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术目的是提供一种念珠藤提取物及其制备方法和应用，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为了实现上述目的，本专利技术是通过如下的技术方案来实现：一种念珠藤提取物的制备方法，首先取8公斤念珠藤根和茎干燥后粉碎，用6倍量70％乙醇浸泡2小时，超声回流提取3次，时间分别为30min、20min、20min，合并提取液，过滤，旋转蒸发仪减压浓缩得浸膏，浸膏以适量硅藻土拌匀，用滤纸筒严密包好后放入索氏提取器抽提筒内，在干燥的索氏提取器抽提筒加入20倍量乙酸乙酯，安装好索氏提取器，在恒温电热套中抽提6小时，提取液旋转蒸发浓缩得浸膏，浸膏采用硅胶柱层析，氯仿－甲醇(6:4)洗脱，洗脱液旋转蒸发回收溶剂后冷冻喷雾干燥，得提取物干燥粉。进一步地，一种念珠藤提取物的念珠藤有效部位提取及抗炎作用的实验研究，包括以下步骤：配制成所需浓度的混悬液、毛细血管通透性实验、角叉菜胶致大鼠胸膜炎实验、念珠藤提取物对RAW264.7细胞的毒性作用分析、酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测炎症因子检测IL-6和TNF-α；(1)配制成所需浓度的混悬液：动物实验临用前用1％CMC溶液研磨、配制成所需浓度的混悬液。细胞实验临用前用0.1％DMSO溶液溶解后使用；(2)毛细血管通透性实验：取小鼠40只，随机分为四组：模型对照组，吲哚美辛组，念珠藤提取物高剂量组，低剂量组，每组10只，雌雄各半，按表1剂量灌胃给药，模型对照组给予等容积1％CMC溶液，1次/d，连续给药5d，末次给药30min后给予小鼠尾静脉注射0.6％伊文思蓝溶液10mL·kg-1，随即腹腔注射0.6％冰醋酸10mL·kg-1，30min后脱臼处死，打开腹腔，用5mL生理盐水洗涤腹腔，吸出洗涤液，合并，3000r·min-1离心15min，取上清液于595nm波长处测定吸收度A值；(3)角叉菜胶致大鼠胸膜炎实验：取大鼠32只，随机分为5组，每组8只，给药方法同(2)，于第5d给药30min后，乙醚麻醉大鼠，正常对照组向右胸腔注入无菌生理盐水0.2ml，其余各组注入1％角叉菜胶无菌溶液0.2ml。致炎4h后水合氯醛麻醉处死大鼠，剪开腹部皮肤，暴露膈肌，于胸腔内注入2ml生理盐水胸腔洗液(胸腔洗液中含5U/ml肝素钠，10μg/ml吲哚美辛)，轻柔震荡，令胸腔内液体均匀混合，取0.1ml作白细胞计数，其余胸腔渗出液3000r/min离心15min，取上清液用Elisa方法测定肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6含量；(4)念珠藤提取物对RAW264.7细胞的毒性作用分析：取对数生长期的RAW264.7细胞，以5×104细胞/ml的细胞密度接种在96孔板中，每孔加入细胞悬液100μl，每组设置8个平行复孔。设置空白组和不同浓度提取物给药组，于37℃、5％(v/v)CO2的培养箱中培养24小时，弃去旧培养基，空白组给于新鲜培养基，提取物给药组分别给予不同浓度的药物，于培养箱中继续培养24小时。24小时后避光条件下向每孔加入30μl的MTT(5mg/ml)，在37℃培养箱中再培养4小时，弃细胞上清溶液，向每孔中加入100μl的DMSO溶解反应后的结晶产物，水平摇床上摇5分钟使充分混合，使用酶标仪于570nm波长处检测各孔的OD值。按以下公式计算细胞存活率：细胞存活率％＝实验组平均OD值/对照组平均OD值×100％；(5)取上清液用Elisa方法测定肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6含量：取对数生长期的RAW264.7细胞，以2×105细胞/ml细胞密度接种在24孔板中，每孔加入500μl的细胞悬液，设置空白组、LPS(1μg/ml)组、不同浓度提取物和LPS(1μg/ml)共同给药组。培养24小时后，弃去旧培养基，空白组给于新鲜培养基，其他组按设置给药，继续培养24小时后，收集各组细胞上清液，3000rmp离心20分钟，取上清液，用ELISA试剂盒检测IL-6和TNF-α的浓度。本专利技术的有益效果：本专利技术通过念珠藤有效部位提取观察抗炎作用的实验研究可准确全方位的分析了念珠藤提取物对醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的影响、念珠藤提取物对胸腔渗出液白细胞数量的影响、念珠藤提取物对胸腔渗出液炎症介质的影响，通过实验分析可知念珠藤提取物物在5，20，30，60μg/ml浓度对RAW264.7细胞24小时基本没有毒性(存活率>85％)，在120，240μg/ml对细胞有一定毒性。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为本专利技术一种念珠藤提取物的制备方法的念珠藤提取物抑制LPS诱导RAW264.7细胞产生IL-6和TNF-α对比图；具体实施方式为使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本专利技术。本专利技术提供一种技术方案：一种念珠藤提取物的制备方法，首先取8公斤念珠藤根和茎干燥后粉碎，用6倍量70％乙醇浸泡2小时，超声回流提取3次，时间分别为30min、20min、20min，合并提取液，过滤，旋转蒸发仪减压浓缩得浸膏，浸膏以适量硅藻土拌匀，用滤纸筒严密包好后放入索氏提取器抽提筒内，在干燥的索氏提取器抽提筒加入20倍量乙酸乙酯，安装好索氏提取器，在恒温电热套中抽提6小时，提取液旋转蒸发浓缩得浸膏，浸膏采用硅胶柱层析，氯仿－甲醇(6:4)洗脱，洗脱液旋转蒸发回收溶剂后冷冻喷雾干燥，得提取物干燥粉，一种念珠藤提取物的念珠藤有效部位提取及抗炎作用的实验研究，包括以下步骤：配制成所需浓度的混悬液、毛细血管通透性实验、角叉菜胶致大鼠胸膜炎实验、念珠藤提取物对RAW264.7细胞的毒性作用分析、酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测炎症因子检测IL-6和TNF-α；(1)配制成所需浓度的混悬液：动物实验临用前用1％CMC溶液研磨、配制成所需浓度的混悬液。细胞实验临用前用0.1％DMSO溶液溶解后使用；(2)毛细血管通透性实验：取小鼠40只，随机分为四组：模型对照组，吲哚美辛组，念珠藤提取物高剂量组，低剂量组，每组10只，雌雄各半，按表1剂量灌胃给药，模型对照组给予等容积1％CMC溶液，1次/d，连续给药5d，末次给药30min后给予小鼠尾静脉注射0.6％伊文思蓝溶液10mL·kg-1，随即腹腔注射0.6％冰醋酸10mL·kg-1，30min后脱臼处死，打开腹腔，用5mL生理盐水洗涤腹腔，吸出洗涤液，合并本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种念珠藤提取物的制备方法，其特征在于：首先取8公斤念珠藤根和茎干燥后粉碎，用6倍量70％乙醇浸泡2小时，超声回流提取3次，时间分别为30min、20min、20min，合并提取液，过滤，旋转蒸发仪减压浓缩得浸膏，浸膏以适量硅藻土拌匀，用滤纸筒严密包好后放入索氏提取器抽提筒内，在干燥的索氏提取器抽提筒加入20倍量乙酸乙酯，安装好索氏提取器，在恒温电热套中抽提6小时，提取液旋转蒸发浓缩得浸膏，浸膏采用硅胶柱层析，氯仿－甲醇(6:4)洗脱，洗脱液旋转蒸发回收溶剂后冷冻喷雾干燥，得提取物干燥粉。/n

【技术特征摘要】
1.一种念珠藤提取物的制备方法，其特征在于：首先取8公斤念珠藤根和茎干燥后粉碎，用6倍量70％乙醇浸泡2小时，超声回流提取3次，时间分别为30min、20min、20min，合并提取液，过滤，旋转蒸发仪减压浓缩得浸膏，浸膏以适量硅藻土拌匀，用滤纸筒严密包好后放入索氏提取器抽提筒内，在干燥的索氏提取器抽提筒加入20倍量乙酸乙酯，安装好索氏提取器，在恒温电热套中抽提6小时，提取液旋转蒸发浓缩得浸膏，浸膏采用硅胶柱层析，氯仿－甲醇(6:4)洗脱，洗脱液旋转蒸发回收溶剂后冷冻喷雾干燥，得提取物干燥粉。


2.一种念珠藤提取物的念珠藤有效部位提取及抗炎作用的实验研究，其特征在于：包括以下步骤：配制成所需浓度的混悬液、毛细血管通透性实验、角叉菜胶致大鼠胸膜炎实验、念珠藤提取物对RAW264.7细胞的毒性作用分析、酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测炎症因子检测IL-6和TNF-α；
(1)配制成所需浓度的混悬液：动物实验临用前用1％CMC溶液研磨、配制成所需浓度的混悬液。细胞实验临用前用0.1％DMSO溶液溶解后使用；
(2)毛细血管通透性实验：取小鼠40只，随机分为四组：模型对照组，吲哚美辛组，念珠藤提取物高剂量组，低剂量组，每组10只，雌雄各半，按表1剂量灌胃给药，模型对照组给予等容积1％CMC溶液，1次/d，连续给药5d，末次给药30min后给予小鼠尾静脉注射0.6％伊文思蓝溶液10mL·kg-1，随即腹腔注射0.6％冰醋酸10mL·kg-1，30min后脱臼处死，打开腹腔，用5mL生理盐水洗涤腹腔，吸出洗涤液，合并，3000r·min-1离心15min，取上清液于595nm波长处测定吸收度A值；
(3)角叉菜胶致大鼠胸膜炎实验：取大鼠32只，随机分为5组，每组8只，给药方法同(2)，于第5d给药30min后，乙醚麻醉大鼠，正常对照组...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵杰，孙奕曦，潘冬梅，
申请(专利权)人：广东药科大学，
类型：发明
国别省市：广东;44