一种用于高分辨空间转录组测序芯片制造技术

组织的空间转录组测序技术对于生物科学以及医学研究例如细胞分化，致病机理等都具有重大的意义；本专利开发出一种基于微米级光锥的高分辨率组织空间转录组信使核糖核酸测序芯片的制备方法，该测序芯片在光锥端面的不同光纤位置结合了一段包含有空间位置标签和逆转录寡聚胸腺嘧啶核苷酸的mRNA捕获探针，以此构建的芯片，使光锥中的每一个光纤单位在端面都带有特定的位置标签来标记出所捕获mRNA的位置信息；组织切片贴于该光锥芯片上，经过透化后组织细胞中的转录组mRNA与光锥芯片上的捕获探针相结合，再通过逆转录，体外扩增和聚合酶链式反应等技术扩增转录组，最后通过Illumina测序平台进行测序并分析。

A high resolution space transcriptome sequencing chip

【技术实现步骤摘要】
一种用于高分辨空间转录组测序芯片
本专利技术涉及的是一种用于高分辨空间转录组测序芯片及其应用方法，属于生物

技术介绍
单细胞分析相较于传统细胞分析技术而言，实现了对单个细胞的检测，突出了细胞的异质性研究，对探究细胞内外分子调控机理，细胞分化过程，癌细胞形成过程都具有重要意义。形成细胞异质性的原因在于基因信息流中的特异性转录形成了不同的mRNA体系，即细胞转录组，相较于基因组而言更具有空间性和时间性。目前分析单细胞转录组的主流技术包括单分子荧光原位杂交（smFISH）和单细胞mRNA测序技术，相较于单分子荧光原位杂交技术只能分析已知序列的局限性，单细胞mRNA测序理论上实现了全转录组分析。单细胞分析可以大致分为单细胞有效分离，全基因组扩增（WGA），测序和序列数据分析这4个部分。目前基于微流控和微孔阵列实现了平行大规模的单细胞分离和利用条形码mRNA捕获珠子实现单细胞组合标记测序。但是通过单细胞分离实现的单细胞测序，失去了细胞在组织中原本的位置信息，细胞的位置信息对探究微环境对细胞分化形成以及细胞之间的调控机理具有重要的意义。因此，本专利技术描述了一种基于光锥的高分辨率空间转录组测序芯片及其应用，使得组织中转录信息具备了空间位置信息，同时又具有多细胞至亚细胞级别的分辨率。该专利技术有利于更好地研究组织内细胞的基因表达和组织病理学分子机制，以至于更全面地理解组织器官功能。
技术实现思路
针对上述目前存在于组织空间转录组学测序方法和技术的不足，本专利技术基于光锥设计了一种用于高分辨率空间转录组测序的芯片，旨在提供一种可以实现组织切片高分辨率空间转录组的测序方法和技术。使用本专利技术，可以将组织切片中细胞内的mRNA进行原位捕获，从而连接到单根光纤的表面，随后通过逆转录和测序过程，即可获得具有组织空间位置信息的转录组序列信息，该测序方法可实现多细胞，单细胞以及亚细胞分辨率的组织空间转录组测序。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：基于光纤光锥的用于高分辨率空间转录组测序芯片，其芯片的制备过程如下：此芯片为光纤束锥形体（以下简称光锥）的缩小端面，将一定数量的光纤紧密排列成束，此光纤束可以从外侧包装成圆形或者多边形，将光纤束经熔拉法拉制成一端大一端小的锥体，随后分别在锥体两端垂直于光纤束轴线的方向切割光纤束，经抛光和清洗等步骤后即可获得两端为一大一小光滑平面的光纤束锥形体，称之为光锥，缩小的一侧平面即为光锥缩小端面。本专利技术中的芯片是在拉制好的锥形光纤缩小端面上所进行的核酸序列修饰。拉制过程为：将一定数量的光纤紧密排列成束，此光纤束可以从外侧包装成圆形或者多边形，将此光纤束置于激光拉制仪中，将光纤束两端固定后，设置好参数开始拉制，光纤束会在激光加热部位熔融变软，并在光纤束两端施加拉力，将光纤束拉制成一端大一端小的锥体，随后分别在锥体两端垂直于光纤束轴线的方向切割光纤束，经抛光和清洗等步骤后即可获得两端为一大一小光滑平面的光纤束锥形体，称之为光锥，缩小的一侧平面即为光锥缩小端面。本方案采用原位光脱保护基团合成法，能够同时在光锥中不同的单根光纤表面修饰上具有不同空间编码序列的捕获探针序列，首先将拉制好的光锥缩小端面进行羟基化处理并利用可光解保护基团进行保护，随后将光锥缩小端面置于反应池中准备进行核苷酸序列的原位合成。一种用于高分辨率空间转录组测序芯片，包括光纤束锥形体，光纤束锥形体由至少2个光纤组成，光纤束锥形体两端为一大一小的两个端面，光纤束锥形体缩小端面的光纤表面上化学修饰了用于编码所捕获mRNA位置信息的核苷酸序列。进一步地，核酸序列合成反应位点的保护基团可以是多种对光不稳定的基团，可以是将光锥缩小端面中的光纤端面进行羟基化处理，并通过4,4’-二甲氧三苯甲基（DMT）光敏保护基团将其保护起来，也可以是光锥缩小端面经过不同处理后所连接上的其他光敏保护基团，如：二硫苏糖醇（DTT）、2-(2-硝基苯基)氯甲酸丙酯（NPPOC）、α-甲基-6-硝基胡椒基氧羰基（MeNPOC）等可选择的光敏保护基团。进一步地，光纤直径在1μm到500μm直径，光锥中光纤呈六方排列。进一步地，单根光纤端面上所修饰的核苷酸序列是通过原位光脱保护基团合成法所获得的，即通过光锥放大端面光源的控制使光源可以在特定的光纤中传导至缩小端面特定位置的光纤表面，从而使该位置上的保护基团脱落，激活该位置上的核酸序列合成反应的发生。进一步地，在光锥的放大端面，通过对光掩模中透光孔开合的控制，可以将紫外光源同时投射到放大端面不同特定位置上的光纤上。因此，该位置上的光源将通过光纤传输到光锥缩小端面中对应的光纤处。此时，该处的保护基团将脱去，便可以与反应池中所存在特定碱基进行耦合反应，从而在特定的光纤表面连接上特定的碱基，此碱基同样带有可光解保护团，以此确保只有一个碱基被合成上。进一步地，通过重复上述步骤，便可按照一定程序来控制掩膜孔的开合和反应池中特定碱基的更换，从而同时在光锥缩小端面中不同单根光纤表面合成上具有不同编码序列信息的捕获序列。由于每根光纤表面上的序列合成是程序化控制的，所以在完成合成后，单根光纤上的序列信息都可以与其在光锥端面上的位置信息所对应起来。进一步地，光锥缩小端面为光滑的平面、经化学腐蚀后所形成的微孔阵列、含有微球的微孔阵列中任意一种。进一步地，光纤缩小端面经过原位光脱保护基团合成法后在光纤表面形成探针序列，探针序列的序列结构包括切除序列、测序和扩增接头序列、空间位置编码序列、分子标签序列以及捕获序列。此探针序列是由不同核苷酸在光纤端面上的单根光纤端面上原位合成所形成的具有一定长度和序列顺序的核酸序列。此一定长度的核酸序列因在序列上的不同位置有不同的序列组成，因而会在下游实验过程中具有不同的功能，因此被赋予不同的名称。因为光锥端面是由光纤束的端面所组成的，所以光锥缩小端面包括了光纤端面。进一步地，在使用上述芯片进行组织切片空间转录组测序时，组织切片贴敷于光锥缩小端面后经过透化杂交，逆转录，体外扩增和测序等步骤后即可获得相应的测序数据。进一步地，在获得测序数据后，带有相同空间位置编码序列的测序数据即为同一根光纤表面所捕获的mRNA序列信息，通过数据分析就可以将不同的测序信息定位到光锥端面上不同的单根光纤位置，从而进一步定位到其在组织中的原始位置，最终获得组织空间转录图谱信息。由于采用了以上技术，本专利技术较现有技术相比，具有的有益效果如下：本方法可以方便地在光锥缩小端面中的每一根光纤端面上同时合成出具有不同序列信息的核酸序列并用于空间转录组测序，应用此芯片可以在组织切片中原位获取转录组信息，并且具有亚细胞级别的空间分辨率，从而分析组织切片中不同位置上细胞的基因表达情况，有利于研究细胞之间的异质性和相互关系，以及疾病发生和发展的分子机制过程。附图说明：图1为光锥结构的结构示意图；图2为光化学探针修饰平台的构建的结构示意图；图3为通过控制掩膜板透光孔的开合，将光源通过光纤传输至光锥缩小端面中特定位置上的光纤表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于高分辨率空间转录组测序芯片，其特征在于：组成光锥缩小端面的光纤表面上化学修饰了用于编码所捕获mRNA位置信息的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于高分辨率空间转录组测序芯片，其特征在于：组成光锥缩小端面的光纤表面上化学修饰了用于编码所捕获mRNA位置信息的核苷酸序列。


2.根据权利要求1所述的一种高分辨率空间转录组测序芯片，其特征在于：单根光纤表面上所修饰的核苷酸序列通过原位光脱保护基团合成法所获得。


3.根据权利要求2所述的一种高分辨率空间转录组测序芯片，其特征在于，原位光脱保护基团合成法的步骤如下：通过光锥放大端面光源的控制使光源在光纤中传导至光锥缩小端面，从而使光锥缩小端面上的保护基团脱落，激活光纤表面上的核酸序列合成反应的发生。


4.根据权利要求3所述的一种高分辨率空间转录组测序芯片，其特征在于：保护基团为对光不稳定的基团、光敏保护基团中任意一种。


5.根据权利要求4所述的一种高分辨率空间转录组测序芯片，其特征在于：光敏保护基团为4,4’-二甲氧三苯甲基、二硫苏糖醇、2-(2-硝基苯基)氯甲酸丙酯、α-甲基-6-硝基胡椒基氧羰基中任意一种。


6.根据权利要求3所述的一种高分辨率空间转录组测序芯片，其特征在于：光锥缩小端面经过原位光脱保护基团合成法后在光纤表面形成探针序列，探针序列的序...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵祥伟，叶凯强，葛芹玉，汪柳菁，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32