GRG1基因改良麻竹株型的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种GRG1基因改良麻竹株型的方法及应用，属于植物基因编辑和麻竹育种技术领域。本发明专利技术利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对麻竹中GRG1的该基因保守功能域进行定向编辑，在靶向GRG1基因的sgRNA引导下，Cas9蛋白对基因组进行定向敲除。以麻竹的愈伤组织作为遗传转化的受体材料：用农杆菌介导法将基因编辑工具盒导入愈伤组织细胞，筛选、鉴定阳性愈伤。经过愈伤分化过程获得的转基因麻竹植株，鉴定遗传转化阳性植株，确定靶向基因编辑情况，最终得到GRG1基因功能缺失，生长加快的麻竹株系。

The method and application of grg1 gene to improve the plant type of Dendrocalamus latiflorus

【技术实现步骤摘要】
GRG1基因改良麻竹株型的方法及应用
本专利技术属于植物基因编辑和麻竹育种
，具体涉及GRG1基因改良麻竹株型的方法及应用。
技术介绍
麻竹是一种大型合轴丛生竹类，具有三个亚基因组的六倍体物种(2n=72,AABBCC)，广泛分布在我国南部各省区。它能产生营养丰富的竹笋，高20米，直径25-30厘米。其产品广泛应用于建筑、工艺品、造纸、水土保持等领域。麻竹是优良的笋材两用竹，其笋鲜嫩甜美，笋期长，其竹竿高大粗壮，可扎竹筏、做水管等建筑材料，也是优质的造纸原料，还可以用来编织生活用品，还具有很高的观赏价值和经济价值。麻竹作为一种重要的植物材料，其产业发展已很难满足日益增长的经济需求。麻竹的育种工作面临巨大的局限性，麻竹虽然是一种丛生竹，具有极强的无性繁殖能力，但是育种方面，只能从引种、选择育种方面入手。到目前为止，作物育种来说，最有成效的育种方法还是杂交育种。对于麻竹来说，杂交育种可行性不大，主要是由于竹类植物的特殊生物学特性——开花无规律且开花后植株即死亡，因此用常规育种手段在麻竹育种上具有极大的困难，这也严重制约该类植物的遗传改良进程。在植物的生长发育过程中，许多因素发挥着作用。这一过程中赤霉素（gibberellins,GAs）发挥着巨大作用，它能够促进着细胞分裂、伸长，打破种子休眠等。赤霉素在植物体内发挥作用，经过细胞内合成，通过信号的转导、传递，将“生长”信号传达至细胞，细胞内与之相关的基因表达发生变化。最后，赤霉素对植物的生长促进作用，是通过影响基因的表达，从而达到调控作用。CRISPR/Cas9系统是21世纪又一伟大的生物技术突破，它能够在依靠单链RNA的导向作用下，将具有DNA内切酶功能的蛋白质特异性靶向目标DNA双链，造成DNA双链断裂（DoubleStrandsDNABreak,DSB），在细胞体内同源修复和非同源修复机制存在下，导致目标DNA双链突变、缺失、替换。这种精准的基因“修饰”作用，使其成为研究基因功能又一个重要手段。麻竹与毛竹，同属于竹类植物，具有很高的物种同源性。在外源赤霉素的处理下，毛竹幼苗植株表现出生长加快，节间伸长等生长“加快”状态。同时，在分子层面上，毛竹体内有些基因表达水平也随着处理发生很大的变化。这些证实了，在毛竹体内这些变化的基因参与着赤霉素控制植物生长这一个过程。本专利技术以毛竹外源赤霉素响应的基因GRG1（GAResponsiveGene1）为模板设计引物，通过同源克隆得到麻竹中对外源赤霉素响应的基因GRG1。通过确定麻竹中GRG1基因序列，选择性靶向GRG1基因的保守功能域，改变麻竹中GRG1基因的表达，从而使植株生长发育出现变化。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有麻竹育种的不足，提供一种GRG1基因改造麻竹株型的方法及应用。本专利技术的方法利用能够精准定向编辑基因的CRISPR/Cas9技术，靶向编辑麻竹中GRG1基因，改变麻竹中GRG1基因的表达，使其功能丧失，从而获得生长加快的麻竹株型。该方法通过基因工程手段，实现麻竹基因定点编辑，以此获得改良的麻竹植株。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种麻竹GRG1基因，所述麻竹GRG1基因存在3个同源拷贝分别GRG1-A、GRG1-B、GRG1-C，其核苷酸序列分别如SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5所示。上述麻竹基因GRG1基因改良麻竹株型的方法，包括以下步骤：（1）麻竹中GRG1基因克隆及靶位点设计；（2）构建sgRNA表达盒，sgRNA表达盒与PUBI-H载体连接，构建麻竹GRG1基因编辑载体；（3）将构建好的麻竹GRG1基因编辑载体转入农杆菌EHA105中，并对麻竹愈伤组织进行携带GRG1基因编辑载体农杆菌EHA105的侵染；（4）进行麻竹愈伤组织筛选、增殖、分化、生根培养；（5）PCR鉴定筛选阳性麻竹突变体植株；（6）对阳性麻竹突变体植株的编辑基因编辑效率和编辑类型进行分析。上述步骤（1）麻竹中GRG1基因克隆及靶位点设计，具体为：依据毛竹GRG1基因设计麻竹中GRG1基因克隆的引物GRG1-F和GRG1-R，其引物序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所述；提取麻竹基因组DAN和cDAN，以麻竹基因组DAN和cDAN为模板，以GRG1-F和GRG1-R为引物，PCR扩增麻竹中GRG1基因；通过克隆和同源克隆策略识别获得麻竹中GRG1基因存在3个拷贝分别GRG1-A、GRG1-B、GRG1-C，在每个拷贝中普遍存在单核苷酸多态性（SNPs）；在克隆获得的GRG1基因一致保守序列处设计靶位点，靶位点target序列为：GCGTGTGCCACCCCAGCGTGAGG，其中AGG为PAM位点。上述步骤（2）中所述sgRNA表达盒的构建具体为：先设计带有特殊碱基接头的含有target的引物，target引物退火互补形成靶点接头，通过酶切、连接手段使靶点接头连接至中间载体pYLsgRNA-OsU6c上，使靶点接头与gRNA组装在一起，构建获得sgRNA表达盒。进一步的，所述带有特殊碱基接头的含有target的引物为：TargetF-c：5’-tcaGCGTGTGCCACCCCAGCGTG-3’，TargetR-c：5’-aaacCACGCTGGGGTGGCACACG-3’.上述GRGR1基因改良麻竹株型的方法在生长加快的麻竹转基因植株育种中的应用。本专利技术的优点在于：本专利技术利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对麻竹GRG1基因进行编辑，通过对转基因植株表型鉴定和DNA水平上鉴定，成功改造获得生长加快的麻竹转基因植株。一种新型麻竹材料极大地促进麻竹育种工作发展，具有较高的应用价值。同时本专利技术通过基因工程的手段，给竹类育种工作打开了一个新思路，CRISPR/Cas9技术在麻竹中的成功运用，精准的定向编辑效应，使对基因的功能性研究更为便捷，将会极大提高育种效率。附图说明图1构建麻竹GRG1基因编辑载体用到的PUBI-H载体和sgRNA表达盒构建用到的中间载体pYLsgRNA-OsU6c的结构。图2麻竹GRG1基因编辑的载体结构图。图3转基因麻竹的鉴定核酸电泳图。M：DNA分子量标准，T0：T0代转基因竹子；wt：野生型竹子，1-28：28个独立的转基因株系，+：含有目标片段的质粒做模板的阳性对照，-：水做模板的阴性对照图4转基因麻竹编辑区域的测序鉴定序列比对结果图。WT:野生型竹子GRG1区域的测序,T0-21:选取的突变体代表，A、B、C分别代表GRG1基因的3个同源拷贝GRG1-A、GRG1-B、GRG1-C，图中添加背景色标识为PAM，加粗标识为纯合突变体编辑情况。图5纯合突变体麻竹的表型鉴定图。A：GRG1纯合突变后呈现植株变高的表型，a:野生型,b:T0-21突变体；B:野生型和突变体茎段长度比较，a:野生型,b:纯合突变体；C:植株高度和茎段长度比较，上图为植株高度统计,下图为茎段长度比较，WT:野本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种麻竹GRG1基因，其特征在于：所述麻竹GRG1基因存在3个同源拷贝，分别GRG1-A、GRG1-B、GRG1-C，其核苷酸序列分别如SEQ ID No .3、SEQ ID No .4、SEQ ID No .5所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种麻竹GRG1基因，其特征在于：所述麻竹GRG1基因存在3个同源拷贝，分别GRG1-A、GRG1-B、GRG1-C，其核苷酸序列分别如SEQIDNo.3、SEQIDNo.4、SEQIDNo.5所示。


2.如权利要求1所述一种麻竹GRG1基因改良麻竹株型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）麻竹中GRG1基因克隆及靶位点设计；
（2）构建sgRNA表达盒，将sgRNA表达盒与PUBI-H载体连接，构建麻竹GRG1基因编辑载体；
（3）将构建好的麻竹GRG1基因编辑载体转入农杆菌EHA105，并以农杆菌介导法对麻竹愈伤组织进行携带GRG1基因编辑载体农杆菌EHA105的侵染；
（4）进行麻竹愈伤组织筛选、增殖、分化、生根培养；
（5）PCR鉴定筛选阳性麻竹突变体植株；
（6）对阳性麻竹突变体植株的编辑基因编辑效率和编辑类型进行分析。


3.根据权利要求2所述的一种麻竹GRG1基因改良麻竹株型的方法，其特征在于：步骤（1）麻竹中GRG1基因克隆及靶位点设计具体为：依据毛竹GRG1基因设计麻竹中GRG1基因克隆的引物GRG1-F和GRG1-R，其引物序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所述；提取麻竹基因组DAN和cDAN，以麻竹基因组DAN和cDAN为模板，以...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱强，陈刚，叶善汶，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35