柚皮素抗原及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种柚皮素抗原及其制备方法与应用，将柚皮素与同时含有氨基和羧基的化合物B进行反应得到化合物C；化合物C和N‑羟基琥珀酰亚胺在二环己基碳二亚胺或1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐存在的条件下进行偶联反应得到化合物D；化合物D与载体蛋白经偶联反应得柚皮素抗原；柚皮素抗原在制备用于检测样品中柚皮素的酶联免疫试剂盒、柚皮素的发光免疫试剂盒或免疫亲和色谱柱中的应用。发明专利技术提供的制备柚皮素抗原的方法，能够方便、快捷地获得柚皮素抗原，合成步骤简洁明了、合成成本低，效果好。用本发明专利技术方法制备的柚皮素抗原进行免疫得到的抗体的特异性好、最低检测限值低。为柚皮素的快速免疫检测应用中将有广阔的前景。

Naringin antigen and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
柚皮素抗原及其制备方法与应用
本专利技术属于生物
，涉及一种柚皮素抗原的制备方法，以及采用该制备方法制得的柚皮素抗原及其应用。
技术介绍
柚皮素是柚皮苷的苷元，广泛存在于芸香科植物中，通用名为Naringenin；化学名为：4'，5，7-三羟基黄酮；商品名为：柚皮苷原、柑橘素；CAS登记号:480-41-1；分子式为：C15H12O5；相对分子量为：272.25。其化学结构式如下：柚皮素(Naringenin)具有雌激素样活性，因而具有促进内皮细胞分泌NO的作用；它可以减轻细胞氧化损伤；它能有效地降低视网膜功能和组织结构的损伤，改善视功能；柚皮素还具有明显的止咳、化痰、平喘作用；柚皮素可以直接抑制T淋巴细胞的激活，从而阻止各种炎症因子的分泌，进而对免疫性急性肝损伤有保护作用。目前，柚皮素提取方法主要有回流法、有机溶剂法、固相萃取法、超声提取法。柚皮素含量分析方法有分光光度法、高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UPLC)、超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)、反相高效液相色谱-二极管阵列检测法(HPLC-DAD)、毛细管区带电泳法、RP-HPLC法等，其灵敏度高，准确性好，但是这几种检测方法需要使用昂贵的仪器设备，检测费用高，耗时长，不适用于现场快速检测。与仪器分析法相比，免疫分析法具有快速、简便、实时、易于进行现场检测、样品前处理简单、灵敏度高、选择性强、适合于高通量分析等优点，而且还能大幅度降低检测成本。基于上述分析，一种能快速、简便、实时对柚皮素进行现场检测，且灵敏度高、选择性强、适用于高通量分析的柚皮素抗原是目前行业内急需的。
技术实现思路
鉴于上述不足，本专利技术提供了一种制备灵敏度高、选择性强、适用于高通量分析的柚皮素抗原的方法以及采用该方法制得的柚皮素抗原及其应用。本专利技术是通过如下手段实现的：本专利技术提供的柚皮素抗原结构通式如式A所示，所述式A中，X为O、S、CH2、NH基团中的一种，n为0-6的整数；Protein表示载体蛋白，所述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中至少一种。本专利技术提供的制备柚皮素抗原(式A)的方法，包括如下步骤：(1)将柚皮素与式B所示同时含有氨基和羧基的化合物进行反应得到式C所示化合物；H2N-X-(CH2)n-COOH式B结构式所述式B和式C中，X为O、S、CH2、NH基团中的一种，n为0-6的整数；(2)式C所示化合物和N-羟基琥珀酰亚胺在二环己基碳二亚胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐存在的条件下进行偶联反应得到式D所示化合物；所述式D中，X为O、S、CH2、NH基团中的一种，n为0-6的整数；(3)式D所示化合物与载体蛋白经偶联反应即得式A所示柚皮素抗原；所述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中至少一种。进一步的，步骤(1)中，式B所示化合物选自羧甲氧基胺、肼基乙酸、氨基乙酸、氨基丙酸、氨基丁酸、氨基戊酸和氨基己酸中至少一种。进一步的，步骤(1)中，所述式B化合物和柚皮素的投料摩尔配比为(0.1-10)：1所述反应的温度为0～100℃，时间为6～48小时；所述反应的溶剂选自吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜和四氢呋喃中至少一种。进一步的，步骤(2)中，式C所示化合物、N-羟基琥珀酰亚胺与二环己基碳二亚胺的摩尔份数比为1：(1～5)：(1～5)；式C所示化合物、N-羟基琥珀酰亚胺与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔份数比为1：(1～5)：(1～5)；所述偶联反应的温度为0～50℃，时间为4～24小时。进一步的，步骤(3)中，式D所示化合物与所述载体蛋白的摩尔份数比为(5～100)：1；所述偶联反应的温度为0～50℃，时间为8～36小时；所述偶联反应在pH值为4～11的条件下进行；式D所示化合物在所述载体蛋白的溶液中进行偶联反应，所述载体蛋白的溶液是由所述载体蛋白加入至缓冲溶液中得到的，所述缓冲溶液选自碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中至少一种，所述缓冲液的pH值均为7.4；进一步的，所述方法还包括将所述偶联反应的反应体系进行透析的步骤；所述透析步骤中，所用透析液为pH值为4～10、浓度为0.01～0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液。按照上述方法制备得到的柚皮素抗原，也属于本专利技术的保护范围。该柚皮素抗原是柚皮素与载体蛋白通过酰胺键连接形成的偶联物；所述酰胺键是式C上的羧基通过活泼酯与载体蛋白上的氨基形成的。由上述本专利技术提供的柚皮素抗原得到的抗体，以及上述抗原和/或抗体在检测样品中柚皮素中的应用、在制备用于检测样品中柚皮素的酶联免疫试剂盒、柚皮素的化学发光免疫试剂盒或免疫亲和色谱柱中的应用，均属于本专利技术的保护范围。其中，所述检测样品为水体、药品、食品或土壤。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的制备柚皮素抗原的方法，能够方便、快捷地获得柚皮素抗原，合成步骤简洁明了、合成成本低，效果好。用本专利技术方法制备的柚皮素抗原进行免疫得到的抗体的特异性好、最低检测限值低。本专利技术的制备柚皮素抗原的方法及由该方法获得的柚皮素抗原在柚皮素的快速免疫检测应用中将有广阔的前景。附图说明图1为柚皮素抗原的合成路线图；图2为建立的柚皮素间接ELISA法标准曲线。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。二环己基碳二亚胺(DCC)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，牛血清白蛋白和卵清白蛋白均购于Sigma公司，羊抗小鼠IgG-HRP购自Jackson公司，邻苯二胺(OPD)，羧甲氧基胺半盐酸盐、柚皮素等其余常规试剂均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。实施例1柚皮素-卵清白蛋白(柚皮素-OVA)抗原的制备(合成路线如图1所示)1)式I所示柚皮素半抗原化合物的合成：在25mL三口瓶中，加入0.2g柚皮素和0.3g羧甲氧基胺半盐酸盐，然后加入5mL吡啶，加热至100度，反应24h后冷却至室温，将反应液倒入20mL水中，用浓盐酸调节pH值为3，用乙酸乙酯(3×25mL)萃取，无水硫酸钠干燥，旋转脱溶，柱层析得到产物0.13g，产率51.4％。1HNMR(600MHz，dmso)δ10.44(s，1H)，7.30(d，J＝8.2Hz，2H)，6.78(d，J＝8.3Hz，2H)，5.91(s，1H)，5.88(s，1H)5.06(d，J＝11.5Hz，1H)，4.68(s，2H)，3.30(d，J＝17.1Hz，1H)，2.91(dd，J＝17.0，11.8Hz，1H)....

【技术保护点】
1.一种柚皮素抗原，其特征在于：结构通式如式A所示，/n

【技术特征摘要】
1.一种柚皮素抗原，其特征在于：结构通式如式A所示，



所述式A中，X为O、S、CH2、NH基团中的一种，n为0-6的整数；Protein表示载体蛋白，所述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中至少一种。


2.根据权利要求1所述的一种柚皮素抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将柚皮素与式B所示同时含有氨基和羧基的化合物进行反应得到式C所示化合物；
H2N-X-(CH2)n-COOH
式B结构式



所述式B和式C中，X为O、S、CH2、NH基团中的一种，n为0-6的整数；
(2)式C所示化合物和N-羟基琥珀酰亚胺在二环己基碳二亚胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐存在的条件下进行偶联反应得到式D所示化合物；



所述式D中，X为O、S、CH2、NH基团中的一种，n为0-6的整数；
(3)式D所示化合物与载体蛋白经偶联反应即得式A所示柚皮素抗原；所述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清蛋白和血蓝蛋白中至少一种。


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，式B所示化合物选自羧甲氧基胺、肼基乙酸、氨基乙酸、氨基丙酸、氨基丁酸、氨基戊酸和氨基己酸中至少一种。


4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，式B化合物和柚皮素的投料摩尔配比为(0.1-10)：1；
所述反应的温度为0～100℃，时间为6～48小时；
所述反应的溶剂选自吡啶、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜和四氢呋喃中至少一种。


5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔永亮，焦必宁，赵静，赵其阳，张耀海，陈爱华，王成秋，何悦，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50