一种分泌抗大黄鱼免疫球蛋白T单克隆抗体的杂交瘤细胞株制造技术

本发明专利技术公开了一种分泌抗大黄鱼IgT单克隆抗体的杂交瘤细胞株IgT‑6，保藏号为：CCTCC NO:C2019215。本发明专利技术以纯化的重组大黄鱼IgT重链胞外区蛋白抗原四次免疫BALB/C小鼠后；将针对大黄鱼IgT抗体效价最高的小鼠取脾细胞，与SP2/0骨髓细胞进行融合，筛选获得抗大黄鱼IgT单克隆抗体的杂交瘤细胞株IgT‑6。用本发明专利技术方法制备获得的单克隆抗体IgT‑6具有特异性强、效价高、稳定性好等特点，可用于大黄鱼疾病的诊断和疫苗使用效果的评价，对大黄鱼疾病的研究及防治具有重要理论和现实意义。

Hybridoma cell line secreting monoclonal antibody against immunoglobulin t of Pseudosciaena crocea

【技术实现步骤摘要】
一种分泌抗大黄鱼免疫球蛋白T单克隆抗体的杂交瘤细胞株
本专利技术属于单克隆抗体制备的
，具体涉及一种分泌抗大黄鱼(Larimichthyscrocea)IgT单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
技术介绍
大黄鱼(Larimichthyscrocea)是我国特有经济鱼种，也是目前我国海水养殖鱼类产量最高的鱼种，2017年产量超过17万吨（2018中国渔业统计年鉴），被农业部列为八大最具优势的出口水产品之一。随着我国海水养殖业的快速发展，养殖规模不断扩大及养殖环境日益恶化，养殖病害防治问题日益突出，成为水产科研工作者的研究重点。从鱼类自身的免疫能力出发来研究其抵御疫病侵袭的机理，不仅有助于认识脊椎动物免疫系统的进化规律及特点，而且有助于促进鱼类疫苗的研制和发展。鱼类是最早出现免疫球蛋白的脊椎动物，虽然与哺乳动物的免疫系统相比还较原始，但是已经形成包括非特异性免疫反应、抗原特异性的细胞免疫和体液免疫等比较完善的免疫应答系统。免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)是鱼类特异性免疫中关键的分子。IgT则是硬骨鱼类中新近发现的一类免疫球蛋白分子，具有与哺乳动物IgA类似的结构和功能；IgT在肠、皮肤、鳃和鼻黏液中以二聚体形式存在，并通过肠、皮肤或鳃上皮细胞表达的多聚免疫球蛋白受体转运至黏液中，其主要参与鱼类局部黏膜免疫应答（ZhangYA,SalinasI,andSunyerJO.RecentfindingsonthestructureandfunctionofteleostIgT[J].FishandShellfishImmunology,2011,31:627-634.）。借助抗大黄鱼IgT单克隆抗体，可进行大黄鱼IgT+B淋巴细胞分选，将为大黄鱼B淋巴细胞的功能及相关免疫学机制研究奠定基础。此外，鱼类感染病原或接种疫苗后，鱼类黏液中产生针对该抗原的特异性抗体，也可以通过该单克隆抗体进行特异性抗体效价检测（ZHANGYA,SALINASI,LIJ,etal.IgT,aprimitiveimmunoglobulinclassspecializedinmucosalimmunity[J].NatureImmunology,2010,11(9):827）。因此，利用抗大黄鱼IgT单克隆抗体，通过检测大黄鱼黏液中该特异性IgT的效价，可进行大黄鱼疾病的诊断和疫苗使用效果的评价，对大黄鱼疾病的研究及防治具有重要理论和现实意义。然而，目前尚未见报道大黄鱼IgT单克隆抗体的研制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于为了解决利用单克隆抗体研究大黄鱼免疫球蛋白结构与功能，将单克隆抗体用于大黄鱼病原微生物检测，协助鱼病诊断与防治等，提供抗大黄鱼IgT单克隆抗体及其制备方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种抗大黄鱼免疫球蛋白T（IgT）的单克隆抗体杂交瘤细胞株IgT-6，所述杂交瘤细胞株IgT-6已于2019年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2019215，中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大学。所述杂交瘤细胞株IgT-6和抗大黄鱼IgT单克隆的制备方法按以下步骤实现：1）制备免疫原-重组大黄鱼IgT蛋白；在步骤1）中，所述制备免疫原的具体方法可为：根据大黄鱼IgT的全基因序列设计一对特异性扩增IgT重链胞外区的引物，采用PCR法扩增IgT重链胞外区，扩增产物回收纯化后，用同源重组酶将其连接到线性化的表达载体pET32a（+）上，构建表达载体pET32a（+）-IgT重链胞外区，并将其转化到感受态细胞E.coliTrans5α。挑取单菌落后提取质粒，经PCR鉴定为阳性的质粒送去测序，测序为阳性的质粒，转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，经IPTG诱导后，经SDS-PAGE鉴定发现表达的重组IgT蛋白大小为29kDa，与预期相符，且主要以可溶性的形式存在。将低温破碎的可溶性表达菌液上清与镍介质结合后，采用不同梯度的低浓度咪唑洗涤杂蛋白，最终用高浓度咪唑洗脱获得高纯度的重组IgT蛋白。所述一对特异性扩增IgT重链胞外区的引物为上游引物F:5’-AATTCGAGCTCCGTCGACACACTTCATTTGCTCCAGAGGTA-3’，下游引物R：5’-CTCGAGTGCGGCCGCATTAGATAAGATCTTTAGATGCCTT-3’；所述IPTG诱导可采用0.5mmol/LIPTG在16℃诱导表达12h；所述不同梯度的低浓度咪唑洗涤杂蛋白为采用20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L和50mmol/L咪唑洗涤5次，每次10mL的量孵育5min。所述高浓度咪唑洗脱可采用300mmol/L咪唑洗脱至考马斯亮蓝染色不变蓝为止。2）制备杂交瘤细胞株IgT-6；在步骤2）中，所述制备杂交瘤细胞株IgT-6的具体方法可为：将纯化的重组IgT蛋白与（不）完全佐剂弗氏佐剂混匀，作为抗原免疫BALB/C小鼠，以骨髓瘤细胞SP2/0与产生抗大黄鱼IgT抗体的小鼠脾细胞融合，获得分泌抗大黄鱼IgT抗体的杂交瘤细胞株IgT-6。3）制备一种抗大黄鱼IgT的单克隆抗体。在步骤3）中，所述制备一种抗大黄鱼IgT的单克隆抗体的具体方法可为：将杂交瘤细胞株IgT-6使用有限稀释法和间接ELISA两种方法结合，筛选出分泌抗大黄鱼IgT单克隆抗体的杂交瘤细胞株IgT-6，得到单克隆抗体。本专利技术所述大黄鱼IgT单克隆抗体，是由杂交瘤细胞株IgT-6产生的、对大黄鱼IgT具有特异性的抗体。该细胞分泌的免疫球蛋白能够高效特异性结合大黄鱼IgT，最高效价达到1：16000。本专利技术所述有限稀释法与间接ELISA方法分别用于获得分泌单一抗体的杂交瘤细胞株和检测抗体效价，均为业内常用方法。本专利技术的有益效果在于：本专利技术是将纯化的重组IgT蛋白免疫动物，取其产生抗大黄鱼IgT单克隆抗体的脾细胞（取自经抗原免疫的动物）与骨髓瘤细胞融合获得能够分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，该细胞株能分泌抗大黄鱼IgT的单克隆抗体。此抗体特异性高，灵敏度高，可用于大黄鱼IgT的结构分析、免疫应答水平检测、病原诊断以及进一步免疫学研究等，具有广阔的应用前景。附图说明图1:Western-blot检测单克隆抗体特异性；M:标准分子量；泳道1：重组IgT蛋白；泳道2：对照蛋白TRX。图2：流式细胞仪检测单克隆抗体标记的淋巴细胞；图A：无关同型一抗对照标记的腮淋巴细胞样品；图B：IgT-6单克隆抗体标记的腮淋巴细胞样品；IgT-6单克隆抗体可以特异性标记大黄鱼头腮淋巴细胞中的IgT+B细胞。图3：免疫荧光标记大黄鱼淋巴细胞。具体实施方式以下对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。抗大黄鱼IgT单克隆抗体的制备方法按以下步骤实现：一、免疫原的制备根据大黄鱼IgT的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗大黄鱼免疫球蛋白T的单克隆抗体杂交瘤细胞株IgT-6，其特征在于：所述杂交瘤细胞株IgT-6已于2019年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2019215，中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大学。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗大黄鱼免疫球蛋白T的单克隆抗体杂交瘤细胞株IgT-6，其特征在于：所述杂交瘤细胞株IgT-6已于2019年9月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C2019215，中国典型培养物保藏中心的地址为中国，武汉，武汉大学。


2.一种大黄鱼IgT单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述杂交瘤细胞株IgT-6分泌产生。

【专利技术属性】
技术研发人员：陈新华，傅秋玲，母尹楠，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35