【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】工程化细菌和使用方法相关申请的交叉引用本申请要求于2017年4月17日提交的美国临时申请62/486,068的基于35U.S.C.§119(e)的权益，出于所有目的，通过引用以其整体明确并入本文。政府支持声明这项工作部分地得到美国国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)的拨款R03DK114536和1K08DK10290201A1号支持。政府在本专利技术中享有某些权利。
技术介绍
测序、质谱和生物信息技术的最新进展促进了我们对微生物组(microbiome)在宿主生理过程中的作用的理解，这些生理过程包括但不限于代谢、炎症、行为和神经系统疾病(Vuong等，AnnuRevNeurosci.(2017)40：21-49)[也引用25271724]。尽管将生理过程与微生物组联系起来在概念上令人兴奋，但该领域仍处于萌芽状态；研究显示出很强的关联性，但几乎尚未显示出微生物群与各种生理过程之间存在明显的机制性关系。例如，由肠道微生物组调节的分析物的绝对数量以及来自肠道上皮的信号传导分子使得难以鉴定可能有助于神经行为过程的微生物组功能。为了发展更好的机制理解和更有效的微生物组介导的疗法，必须采用强调肠道微生物组功能性调节的不同方法。
技术实现思路
在一方面，提供了将治疗性多肽递送至需要其的哺乳动物受试者的方法。在某些实施方式中，所述方法包括：a)从供体受试者获得包含细菌细胞的微生物组样品；b)从微生物组样品中分离细菌细胞，其中，分离的细菌细胞来自供体受试者共生(c...
【技术保护点】
1.一种向有需要的哺乳动物受试者递送治疗性多肽的方法，所述方法包括：/na)从供体受试者获得包含细菌细胞的微生物组样品；/nb)从所述微生物组样品中分离细菌细胞，其中，所述细菌细胞来自供体受试者共生/原生的细菌菌株；/nc)对分离的细菌细胞进行体外培养以产生基本上同质的分离和培养的细菌细胞群；/nd)用与所述细菌和/或供体受试者异源的一种或多种多核苷酸转化所述细菌细胞群，其中，所述一种或多种多核苷酸编码一种或多种治疗性多肽；和/ne)将至少一部分基本上同质且经转化的分离和培养的细菌细胞群施用至或使其被施用至接受受试者，其中，所施用的细菌细胞能够在哺乳动物受试者中或其上永久或长期定殖并表达所述一种或多种治疗性多肽。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170417 US 62/486,0681.一种向有需要的哺乳动物受试者递送治疗性多肽的方法，所述方法包括：
a)从供体受试者获得包含细菌细胞的微生物组样品；
b)从所述微生物组样品中分离细菌细胞，其中，所述细菌细胞来自供体受试者共生/原生的细菌菌株；
c)对分离的细菌细胞进行体外培养以产生基本上同质的分离和培养的细菌细胞群；
d)用与所述细菌和/或供体受试者异源的一种或多种多核苷酸转化所述细菌细胞群，其中，所述一种或多种多核苷酸编码一种或多种治疗性多肽；和
e)将至少一部分基本上同质且经转化的分离和培养的细菌细胞群施用至或使其被施用至接受受试者，其中，所施用的细菌细胞能够在哺乳动物受试者中或其上永久或长期定殖并表达所述一种或多种治疗性多肽。
2.如权利要求1所述的方法，其进一步包括确定和/或测量所施用的细菌细胞在所述哺乳动物受试者中或其上的定殖或存在的步骤。
3.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述微生物组样品获自选自由以下组成的组的生物样品：身体排泄物(例如，粪便、唾液、粘液、尿液或呼出物)，表面(例如，胃肠道、口腔、咽、鼻腔、泌尿生殖道、皮肤、肛门/直肠、阴道或眼)的活检或拭子，和病理标本(例如，癌组织、截肢肢体或发炎器官)。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述细菌细胞不包含编码致病毒素的多核苷酸。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述细菌细胞不包含编码一种或多种致病毒素的一种或多种多核苷酸，所述毒素选自由以下组成的组：AB毒素、α毒素、炭疽毒素、肉毒杆菌毒素、蜡样芽孢杆菌毒素、胆固醇依赖性溶血素、梭菌细胞毒素家族、肉毒梭菌C3毒素、艰难梭菌毒素A、艰难梭菌毒素B、梭菌肠毒素、产气荚膜梭菌α毒素、产气荚膜梭菌β毒素、Cry1Ac、Cry6Aa、Cry34Ab1、δ内毒素、白喉毒素、肠毒素、B型肠毒素、红细胞毒素、脱落素、脆性溶素、溶血素E、不耐热肠毒素、耐热肠毒素、溶血素、HrpZ家族、杀白细胞素、李斯特菌溶血素O、Panton–Valentine杀白细胞素、完整毒力岛、酚可溶性调节肽、肺炎球菌溶血素、成孔毒素、假单胞菌外毒素、绿脓菌素、抗真核Rhs毒素、RTX毒素、志贺毒素、志贺样毒素、金黄色葡萄球菌α毒素、金黄色葡萄球菌β毒素、金黄色葡萄球菌δ毒素、链球菌溶血素、破伤风菌溶血素、破伤风痉挛毒素、中毒性休克综合征毒素、气管细胞毒素和/或vero细胞毒素。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述细菌细胞对用于选择经转化的细菌细胞的一种或多种抗生素剂具有抗生素敏感性，所述抗生素剂为例如卡那霉素、氯霉素、羧苄西林、潮霉素和/或甲氧苄啶。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述细菌细胞对一种或多种临床使用的抗生素剂不具有抗生素抗性。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述细菌细胞对选自以下抗生素的一种或多种抗生素剂没有抗生素抗性：大环内酯类(例如，阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、非达霉素、泰利霉素、碳霉素A、交沙霉素、吉他霉素、麦迪霉素/醋酸麦迪霉素、竹桃霉素、索利霉素、螺旋霉素、醋竹桃霉素、泰乐菌素/泰洛星或罗红霉素)、利福霉素类(例如，利福平(或立复霉素)、利福布汀、利福喷丁、利福拉齐或利福昔明)、多粘菌素类(例如，多粘菌素B或多粘菌素E(粘菌素))、喹诺酮类抗生素(例如，萘啶酸、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、依诺沙星、洛美沙星、格雷沙星、曲伐沙星、司帕沙星、替马沙星、莫西沙星、加替沙星、吉米沙星)、β-内酰胺类(例如，青霉素、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、替莫西林、阿莫西林、氨苄西林、美西林、羧苄西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林或哌拉西林)、氨基糖苷类(例如，阿米卡星、庆大霉素、新霉素、链霉素或妥布霉素)、头孢菌素类(例如，头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢克洛、头孢西丁、头孢丙烯、头孢呋辛、氯碳头孢、头孢克肟、头孢地尼、头孢妥仑、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢泊肟、头孢吡肟或头孢比普)、单环β-内酰胺类(例如，氨曲南、替吉莫南、诺卡霉素A或烟草野火病菌氨酸-β-内酰胺)、碳青霉烯类(例如，比阿培南、多尼培南、厄他培南、法罗培南、亚胺培南、美罗培南、帕尼培南、阿祖培南、泰比培南或硫霉素)或四环素类(例如，四环素、氯四环素、氧四环素、地美环素、赖甲环素、甲氯环素、甲烯土霉素、米诺环素、罗利环素或替加环素)。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种异源多核苷酸编码荧光蛋白，例如，绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白(mCherry、mEos2、mRuby2、mRuby3、mClover3、mApple、mKate2、mMaple、mCardinal、mNeptune)、mTurquoise或mVenus。
10.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种异源多核苷酸编码酶、细胞因子或肽激素。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述酶是：胆盐水解酶，例如来自乳杆菌属的胆盐水解酶、例如bshA(基因ID3251811)或bshB(基因ID3252955)，N-酰基磷脂酰乙醇胺(NAPE)水解性磷脂酶D，伴放线菌放线杆菌分散蛋白B(DspB)，乳糖酶(β-半乳糖苷酶)，醛脱氢酶，醇脱氢酶(例如，ADH1A，ADH1B，ADH1C，ADH2，ADH3，ADH4，ADH5，ADH6或ADH7)，胆酸-CoA:氨基酸N-酰基转移酶(BAAT)，苯丙氨酸羟化酶，丁酸合成途径的酶，黑曲霉来源的脯氨酰内切蛋白酶(AN-PEP)，7α-羟类固醇脱氢酶(7-α-HSDH)，7β-羟类固醇脱氢酶(7-β-HSDH)或胆酰甘氨酸水解酶和胆酸7α-脱羟基酶。
12.如权利要求10所述的方法，其中，所述细胞因子选自哺乳动物(例如，人)IL-10、哺乳动物(例如，人)IL-27二聚体(分别表达或作为融合蛋白表达的IL27α亚基和/或Epstein-Barr病毒诱导因子3(EBI3)亚基)、或TGF-β。
13.如权利要求10所述的方法，其中，所述肽激素选自由以下组成的组：哺乳动物胰高血糖素、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、哺乳动物胰高血糖素样肽2(GLP-2)、成纤维细胞生长因子1(FGF1)、成纤维细胞生长因子15(FGF15)、成纤维细胞生长因子19(FGF19)、胰岛素和胰岛素原。
14.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种异源多核苷酸编码阿克曼氏菌Amuc_1100、创伤弧菌鞭毛蛋白B、弹性蛋白酶抑制剂、三叶因子1(TFF1)、三叶因子2(TFF2)、三叶因子3(TFF3)、抗TNFα抗体/纳米抗体或它们的片段或单链、椭孢念珠藻蓝藻抗病毒蛋白-N或小菌素J25(MccJ25)。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，所述一种或多种异源多核苷酸包含密码子偏好性，所述密码子偏好性被配置为改善或增强异源蛋白在经转化的分离和培养的细菌细胞群中的表达。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种异源多核苷酸整合到经转化的细菌细胞群的染色体中。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述一种或多种异源多核苷酸整合到细菌基因组的attB基因和/或yfgG基因中。
18.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种异源多核苷酸处在游离地引入经转化的细菌细胞群中的质粒中。
19.如权利要求18所述的方法，其中，经转化的细菌细胞还包含质粒保留或维持系统，例如，分配系统或毒素-抗毒素模块或系统。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种异源多核苷酸整合到表达盒中，所述表达盒与SEQIDNO:2具有至少或至少约80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的序列同一性，并在Ptrc启动子的控制下表达。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中，所述异源多核苷酸在组成型启动子的控制下表达。
22.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中，所述异源多核苷酸在诱导型启动子的控制下表达。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中，所述细菌细胞来自革兰氏阴性细菌菌株。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中，所述细菌细胞源自选自由以下组成的组的细菌属：拟杆菌属(例如，另枝菌属、普氏菌属、副普氏菌属、副拟杆菌属或臭味杆菌属)、梭菌属、链球菌属、乳球菌属、直肠真杆菌、大肠杆菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、双歧杆菌属、葡萄球菌属、乳杆菌属、韦荣球菌属、嗜血杆菌属、莫拉氏菌属、棒状杆菌属和丙酸杆菌属。
25.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中，所述细菌细胞源自大肠杆菌。
26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中，可检测比例的所施用的细菌细胞稳定地定殖于其所施用的组织或表面，持续至少或至少约2、3、4、5、6、7天，例如，至少或至少约1周，例如，至少或至少约2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、100、125周以上，例如，持续受试者的整个生命周期或在上述任两个时间段所定义的范围内的一段时间。
27.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中，可检测比例的所施用的细菌细胞稳定且永久地定殖于其所施用的组织或表面。
28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中，至少或至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的所施用的细菌细胞稳定地定殖于其所施用的组织或表面。
29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中，所述细菌细胞：
i)能够代谢一种或多种碳水化合物，所述碳水化合物选自由以下组成的组：蔗糖、木糖、d-麦芽糖、N-乙酰-d-氨基葡萄糖、d-半乳糖和d-核糖；
ii)利用糖酵解底物和糖异生底物；
iii)不能活动(例如，鞭毛无法正常发挥功能，例如，由于flhDC操纵子的突变)；
iv)能够产生5-磷酸核糖；
v)能够在缺乏维生素B12(氰钴胺)的限定培养基中生长(例如，被证明是维生素B12的原养生物)；
vi)表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶和/或糖基转移酶；
vii)包含编码色氨酸合酶基因β亚基的基因的多个拷贝；
viii)包含编码丙酸CoA-转移酶的基因的多个拷贝；
ix)表达荚膜多糖(CPS)4(CPS4)；
x)表达rnf样氧化还原酶复合物；
xi)分解代谢色氨酸以产生吲哚和其他吲哚代谢产物，例如，吲哚-3-丙酸酯和吲哚-3-醛；和/或
xii)不产生任何诱导双链DNA断裂的试剂，例如，没有编码巨大的模块化非核糖体肽和聚酮化合物合酶的基因组岛、表达杂合肽-聚酮化合物基因毒素、和/或没有活性clbA基因。
30.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中，受试者是人。
31.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中，施用至少或至少约106、107、108、109、1010、1011、1012、1013个细菌细胞。
32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中，供体受试者和接受受试者是同一个体，例如，其中微生物组样品是受试者自体的。
33.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中，供体受试者和接受受试者是不同个体。
34.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中，将所施用的细菌细胞施用至所述微生物组样品所获自的相同组织或表面。
35.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中，所述微生物组样品获自皮肤或眼，并且将所施用的细菌细胞局部施用至所述受试者，例如在缓冲悬液、凝胶、洗剂、乳膏或软膏中局部施用。
36.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中，所述微生物组样品获自鼻腔，并且所施用的细菌细胞通过鼻管进行施用。
37.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中，所述微生物组样品获自阴道，并且所施用的细菌细胞经阴道内施用。
38.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中，所述微生物组样品获自胃肠道，并且所施用的细菌细胞经口服或直肠施用于受试者。
39.如权利要求38所述的方法，其中，所施用的细菌细胞经胃管或以可食用组合物的形式口服施用于受试者。
40.如权利要求39所述的方法，其中，所述可食用组合物包含凝胶胶囊，所述凝胶胶囊包含所施用的细菌细胞或所施用的细菌细胞经包封。
41.如权利要求39所述的方法，其中，所述可食用组合物选自由以下组成的组：酸奶、奶、冰淇淋、蔬菜泥、水果泥、雪葩和燕麦片。
42.如权利要求39所述的方法，其中，所述可食用组合物是饮料。
43.如权利要求42所述的方法，其中，所述饮料是缓冲溶液。
44.如权利要求1至43中任一项所述的方法，其中，将所施用的细菌细胞多次施用于受试者，例如，以每天、每周、每两周或每月的间隔施用。
45.如权利要求1至44中任一项所述的方法，其中，将所施用的细菌细胞以每天、每周、每两周或每月的间隔施用于受试者。
46.如权利要求1至45中任一项所述的方法，其中，所施用的转化的细菌细胞不改变接受受试者的微生物组。
47.与哺乳动物共生的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述基本上同质的细菌群经转化以表达与所述哺乳动物和/或所述细菌异源的一种或多种多核苷酸。
48.如权利要求47所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，与哺乳动物共生的细菌群能够或被配置成永久或长期地定殖在哺乳动物中或哺乳动物上。
49.如权利要求47至48中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述细菌细胞群能够或被配置成在哺乳动物中或哺乳动物上定殖至少或至少约2、3、4、5、6、7天，例如，至少或至少约1周，例如，至少或至少约2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、100、125周以上，例如，哺乳动物的生命周期。
50.如权利要求47至49中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述细菌细胞：
i)能够代谢一种或多种碳水化合物，所述碳水化合物选自由以下组成的组：蔗糖、木糖、d-麦芽糖、N-乙酰-d-氨基葡萄糖、d-半乳糖和d-核糖；
ii)利用糖酵解底物和糖异生底物；
iii)不能活动(例如，鞭毛无法正常发挥功能，例如，由于flhDC操纵子的突变)；
iv)能够产生5-磷酸核糖；
v)能够在缺乏维生素B12(氰钴胺)的限定培养基中生长(例如，被证明是维生素B12的原养生物)；
vi)表达UDP-葡萄糖-4-差向异构酶和/或糖基转移酶；
vii)包含编码色氨酸合酶基因β亚基的基因的多个拷贝；
viii)包含编码丙酸CoA-转移酶的基因的多个拷贝；
ix)表达荚膜多糖(CPS)4(CPS4)；
x)表达rnf样氧化还原酶复合物；
xi)分解代谢色氨酸以产生吲哚和其他吲哚代谢产物，例如，吲哚-3-丙酸酯和吲哚-3-醛；和/或
xii)不产生任何诱导双链DNA断裂的试剂，例如，没有编码巨大的模块化非核糖体肽和聚酮化合物合酶的基因组岛、表达杂合肽-聚酮化合物基因毒素、和/或没有活性clbA基因。
51.如权利要求47至50中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述细菌细胞群不包含编码一种或多种致病毒素的一种或多种多核苷酸，所述毒素选自由以下组成的组：AB毒素、α毒素、炭疽毒素、肉毒杆菌毒素、蜡样芽孢杆菌毒素、胆固醇依赖性溶血素、梭菌细胞毒素家族、肉毒梭菌C3毒素、艰难梭菌毒素A、艰难梭菌毒素B、梭菌肠毒素、产气荚膜梭菌α毒素、产气荚膜梭菌β毒素、Cry1Ac、Cry6Aa、Cry34Ab1、δ内毒素、白喉毒素、肠毒素、B型肠毒素、红细胞毒素、脱落素、脆性溶素、溶血素E、不耐热肠毒素、耐热肠毒素、溶血素、HrpZ家族、杀白细胞素、李斯特菌溶血素O、Panton–Valentine杀白细胞素、完整毒力岛、酚可溶性调节肽、肺炎球菌溶血素、成孔毒素、假单胞菌外毒素、绿脓菌素、抗真核Rhs毒素、RTX毒素、志贺毒素、志贺样毒素、金黄色葡萄球菌α毒素、金黄色葡萄球菌β毒素、金黄色葡萄球菌δ毒素、链球菌溶血素、破伤风菌溶血素、破伤风痉挛毒素、中毒性休克综合征毒素、气管细胞毒素和/或vero细胞毒素。
52.如权利要求47至51中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述细菌细胞群对用于选择经转化的细菌细胞的一种或多种抗生素剂具有抗生素抗性，所述抗生素剂为例如卡那霉素、氯霉素、羧苄西林、潮霉素和/或甲氧苄啶。
53.如权利要求47至52中任一项所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述细菌细胞群对临床使用的抗生素剂不具有抗生素抗性。
54.如权利要求53所述的基本上同质的细菌细胞群，其中，所述细菌细胞对选自以下抗生素的一种或多种临床使用的抗生素剂没有抗生素抗性：大环内酯类(例如，阿奇霉素、克拉霉...
【专利技术属性】
技术研发人员：S·布朗，A·扎林帕尔，J·斯奈德，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US
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