一种ATP体外磷酸化样本制备方法技术

一种ATP体外磷酸化样本制备方法，包括以下步骤：细胞培养；收集细胞，得到细胞沉淀；细胞蛋白提取：将步骤S2中所收集的细胞沉淀置于冰中并加入细胞裂解液，超声裂解细胞，冰育之后低温离心得到蛋白提取液，所述超声裂解细胞时长为10min；向步骤S3中所述蛋白提取液中加入ATP，使ATP终浓度为5mM，混匀后于30℃恒温水浴孵育1h，得到蛋白提取液；蛋白浓度测定后蛋白变性；样本稀释后于‑80℃保存。本发明专利技术不需要用众多的药物去刺激细胞，得到一个又一个的磷酸化蛋白，在这个体系内，我们可以实现几乎所有蛋白质的磷酸化，这在磷酸化抗体验证方面是有起到了很好的作用。

A method for preparing ATP phosphorylated samples in vitro

【技术实现步骤摘要】
一种ATP体外磷酸化样本制备方法
本专利技术设计一种样本制备方法，更具体地，涉及一种ATP体外磷酸化样本制备方法。
技术介绍
体内磷酸化的研究和发展已较为成熟，通过体内让蛋白质发生磷酸化的方式主要有两种类型：其一是根据生物体内的信号转导通路，对通路上某一个、某几个或者某一类蛋白质进行磷酸化，所以这种方式往往伴随着信号通路的研究，需要去找到合适的物质刺激细胞，让细胞体内在该信号通路上被激活或者关闭，从而得到需要的磷酸化蛋白。其二是根据蛋白质发生磷酸化所需要的蛋白激酶的活性来实现，这种方式也需要去找到合适的物质来让相关的蛋白激酶激活或者失活，从而得到需要的磷酸化蛋白。一方面由于生物体内的信号通路众多，每一个信号通路激活和关闭所需要的药物刺激方式都不一样，另一方面，仅仅是哺乳动物生物体内的蛋白激酶也多达500多种，调节这些蛋白激酶的活性也需要很多种不同的药物刺激。所以在体内实现蛋白质的磷酸化，优点就是方式比较简单，有很多方式也得到了生物研究者的公认，可供参考的研究内容也非常广泛。缺点是，无法得到广谱的磷酸化蛋白，单个药物只能得到少部分蛋白的磷酸化，当我们需要众多的磷酸化蛋白时，就不得不用每种药物分别处理细胞，这样耗时更久，实验更繁琐。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种ATP体外磷酸化样本制备方法，不需要用众多的药物去刺激细胞，得到一个又一个的磷酸化蛋白，在这个体系内，我们可以实现几乎所有蛋白质的磷酸化，这在磷酸化抗体验证方面是有起到了很好的作用。本专利技术，一种ATP体外磷酸化样本制备方法，包括以下步骤：S1、细胞培养；S2、收集细胞，得到细胞沉淀；S3、细胞蛋白提取：将步骤S2中所收集的细胞沉淀置于冰中并加入细胞裂解液，超声裂解细胞，冰育之后低温离心得到蛋白提取液；所述超声裂解细胞时长为10min；S4、ATP孵育：向步骤S3中所述蛋白提取液中加入ATP，使ATP终浓度为5mM，混匀后于30℃恒温水浴孵育1h，得到蛋白提取液；S5、蛋白浓度测定后蛋白变性；S6、样本稀释后于-80℃保存。进一步地，步骤S3中所述细胞裂解液制备方法：准备20mMTris-HCl、150mMNaCl、1mMEDTA、1mMEGTA和1vol.％TritonX-100的溶液，并加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，所述蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的加入量均为每10mL裂解液加入一粒蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，于-20℃下保存；步骤S3中所述细胞裂解液加入量为每1～2×107个细胞添加细胞裂解液1mL；步骤S3中所述超声裂解细胞方法为：10％输出功率进行细胞裂解，每次超声5秒，需停顿2秒，再进行第二超声，根据细胞体积确定超声次数，超声结束时，细胞裂解液不再粘稠，且EP管中液体为澄清状态，如果需要超声5次以上，每超声5次冰育1分钟。还进一步地，步骤S1中所述细胞培养方法为：细胞复苏后，无菌条件下细胞传代；所述细胞复苏为：将细胞于42℃下融化后离心，去除上清液，加入培养基并用移液枪将细胞吹打成悬浮液，转移至培养瓶中置于培养箱中培养；所述细胞传代为：贴壁细胞细胞覆盖率达到80％～90％时，去除培养基后，加入1×PBS和胰蛋白酶分别润洗后，留少量胰蛋白酶在瓶底，置于培养箱中消化，至肉眼观察容器壁上细胞层呈沙状滑动并且在显微镜下观察细胞轮廓呈圆形时，加入培养基，轻轻晃动培养瓶，用吸管吸取细胞悬液吹打细胞，细胞悬液分装至培养瓶中，细胞传代周期为2～3天；悬浮细胞细胞覆盖率达到80％～90％时，吸取原有培养基并离心，弃上清液并加入培养基，得到的细胞悬浮液置于培养瓶中，细胞传代周期为2～3天；所述培养瓶根据细胞生长状况选用T25、T75或者T175瓶，所述1×PBS和胰蛋白酶润洗的体积为：T25瓶1mL1×PBS和1mL胰蛋白酶，T75瓶3mL1×PBS和4～5mL胰蛋白酶，T175瓶2.5～3mL1×PBS和4～5mL胰蛋白酶；所述终止消化加入的培养基为：T25瓶加入4mLDMEM培养基，T75瓶加入9mLDMEM培养基，T175瓶加入7～8mLDMEM培养基。更进一步地，步骤S2中所述收集细胞方法为：对于悬浮细胞，用吸管吸取培养皿中液体并进行吹打，使之混匀，将混匀后的细胞悬液转移到离心管中，离心并去除上清液，加入1×PBS并慢慢将细胞吹散，吸取细胞悬浮液并再次离心，去除上清液，既得细胞沉淀；对于贴壁细胞，去除培养基并加入1×PBS，用细胞刮刀快速将皿上的细胞刮下，离心并去除上清液，加入1×PBS并慢慢将细胞吹散，吸取细胞悬浮液并再次离心，去除上清液，既得细胞沉淀。更进一步地，步骤S5中所述蛋白变性为：A、当步骤S4中的蛋白提取液中蛋白浓度为2.4～10mg/mL时，向蛋白提取液中加入体积为上清液体积的1/5的6×LoadingBuffer，95℃加热变性10min；B、当步骤S4中的蛋白提取液中蛋白浓度为0.01～2.4mg/mL时，透析浓缩蛋白后测定蛋白浓度并重复步骤A。更进一步地，步骤S6中所述样品稀释方法是利用1×LoadingBuffer将样本浓度稀释为2mg/mL。本专利技术的有益效果是：本专利技术不需要用众多的药物去刺激细胞，得到一个又一个的磷酸化蛋白，在这个体系内，我们可以实现几乎所有蛋白质的磷酸化，这在磷酸化抗体验证方面是有起到了很好的作用。附图说明图1是本专利技术中的对照实验中阴性对照和阳性对照与对比例1(第一组)、对比例2(第二组)的WB实验结果图；图2是本专利技术中的对照实验中阴性对照和阳性对照与实施例1(第三组)、对比例3(第四组)的WB实验结果图；图3是本专利技术中的对照实验中阴性对照和阳性对照与对比例4(第五组)的WB实验结果图；图4是本专利技术中的对照实验中对照实验中阴性对照和阳性对照与对比例5(第一组)、对比例6(第二组)的WB实验结果图；图5是本专利技术中的对照实验中对照实验中阴性对照和阳性对照与实施例1(第三组)、对比例7(第四组)的WB实验结果图；图6是本专利技术中的对照实验中阴性对照和阳性对照与对比例8(第五组)的WB实验结果图。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式并参照附图，对本专利技术进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本专利技术的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本专利技术的概念。实施例11.细胞培养：1.1.细胞复苏将冻存的Hela细胞取出并立即投入42℃恒温水浴锅中，轻微摇动使细胞快速融化，待完全融化后，拿出冻存管并将冻存管放置50mL离心管中，配平，1000rpm/min离心5min。离心结束，取出冻存管，喷点酒精放进超净工作台，点燃酒精灯，打开T25细胞培养瓶，加入4mLDMEM培养基(BoehringerIngelheim/BI)；拧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种ATP体外磷酸化样本制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1、细胞培养；/nS2、收集细胞，得到细胞沉淀；/nS3、细胞蛋白提取：将步骤S2中所收集的细胞沉淀置于冰中并加入细胞裂解液，超声裂解细胞，冰育之后低温离心得到蛋白提取液；/n所述超声裂解细胞时长为10min；/nS4、ATP孵育：向步骤S3中所述蛋白提取液中加入ATP，使ATP终浓度为5mM，混匀后于30℃恒温水浴孵育1h，得到蛋白提取液；/nS5、蛋白浓度测定后蛋白变性；/nS6、样本稀释后于-80℃保存。/n

【技术特征摘要】
1.一种ATP体外磷酸化样本制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、细胞培养；
S2、收集细胞，得到细胞沉淀；
S3、细胞蛋白提取：将步骤S2中所收集的细胞沉淀置于冰中并加入细胞裂解液，超声裂解细胞，冰育之后低温离心得到蛋白提取液；
所述超声裂解细胞时长为10min；
S4、ATP孵育：向步骤S3中所述蛋白提取液中加入ATP，使ATP终浓度为5mM，混匀后于30℃恒温水浴孵育1h，得到蛋白提取液；
S5、蛋白浓度测定后蛋白变性；
S6、样本稀释后于-80℃保存。


2.根据权利要求1所述的ATP体外磷酸化样本制备方法，其特征在于：
步骤S3中所述细胞裂解液制备方法：准备20mMTris-HCl、150mMNaCl、1mMEDTA、1mMEGTA和1vol.％TritonX-100的溶液，并加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，所述蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的加入量均为每10mL裂解液加入一粒蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，于-20℃下保存；
步骤S3中所述细胞裂解液加入量为每1～2×107个细胞添加细胞裂解液1mL；
步骤S3中所述超声裂解细胞方法为：10％输出功率进行细胞裂解，每次超声5秒，需停顿2秒，再进行第二超声，根据细胞体积确定超声次数，超声结束时，细胞裂解液不再粘稠，且EP管中液体为澄清状态，如果需要超声5次以上，每超声5次冰育1分钟。


3.根据权利要求1所述的ATP体外磷酸化样本制备方法，其特征在于：
步骤S1中所述细胞培养方法为：细胞复苏后，无菌条件下细胞传代；
所述细胞复苏为：将细胞于42℃下融化后离心，去除上清液，加入培养基并用移液枪将细胞吹打成悬浮液，转移至培养瓶中置于培养箱中培养。


4.根据权利要求1所述的ATP体外磷酸化样本制备方法，其特征在于：
步骤S1中所述细胞传代为：贴壁细胞细胞覆盖率达到80％～90％时，去除培养基后，加入1×PBS和胰蛋白酶分别润洗后，留少量胰蛋白酶在瓶底，置于培养箱中消化，至肉眼观察容...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄长青，李军，陈文，
申请(专利权)人：武汉爱博泰克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42