米曲霉LCCC30141在生产中性蛋白酶和烟叶发酵中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141在生产中性蛋白酶和烟叶发酵中的应用，米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141能够产生高酶活性的中性蛋白酶，利用米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141生产中性蛋白酶，为中性蛋白酶的生产来源提供了一个新的途径，可以实现中性蛋白酶的规模化生产；将具有产高酶活力的中性蛋白酶的米曲霉应用到烟叶发酵中，能够加速烟叶中蛋白质的分解，明显缩短烟叶的发酵周期，提升烟叶的品质。

Application of Aspergillus oryzae lccc30141 in the production of neutral protease and tobacco fermentation

【技术实现步骤摘要】
米曲霉LCCC30141在生产中性蛋白酶和烟叶发酵中的应用
本专利技术涉及米曲霉(Aspergillusoryzae)LCCC30141在生产中性蛋白酶烟叶发酵中的应用，属于微生物应用的

技术介绍
中性蛋白酶又名沙雷肽酶，属于一种内切酶，可用于各种蛋白质水解处理。在一定温度、PH值下，能将动植物中的大分子蛋白质水解为氨基酸等产物。米曲霉属于曲霉属，黄曲霉群米曲霉种，是我国酿造业的主要菌种，它具有蛋白酶活力高，生长快，适应性强，安全无毒等优点，是生产中性蛋白酶的优良菌株。目前，烟叶的发酵多数采用自然发酵与人工发酵。自然发酵主要是借助自然气候的变化进行发酵的，它的主要特点是在烟叶贮藏期间，利用一年一度的春季温度上升，促进烟叶内酶的活动，使烟叶经过缓慢的发酵过程，以达到改善烟叶品质的目的。人工发酵是利用人为的适合烟叶内在品质变化的条件(即适宜的温度和湿度)，促使烟叶加快变化的方法。但两种方法均存在发酵进展缓慢的缺陷。现有技术CN105950481B公开了一种米曲霉AspergillusoryzaeHGD12菌株，该米曲霉HGD12菌株高产蛋白酶，其酸性蛋白酶活大于1000U/g，碱性蛋白酶活大于10000U/g，中性蛋白酶活大于9000U/g，但该菌株主要具有高酶活性的碱性蛋白酶。现有技术中未见利用已有的米曲霉菌株用来生产高活性中性蛋白酶及在烟叶发酵中的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种米曲霉(Aspergillusoryzae)LCCC30141在生产中性蛋白酶和烟叶发酵中的应用，米曲霉(Aspergillusoryzae)LCCC30141能够高产中性蛋白酶，十分适用于生产中性蛋白酶和烟叶发酵。一方面，本专利技术提供了米曲霉(Aspergillusoryzae)LCCC30141在生产中性蛋白酶中的应用，米曲霉(Aspergillusoryzae)LCCC30141能够产生高酶活性的中性蛋白酶，为中性蛋白酶的生产来源提供了一个新的来源。另一方面，本专利技术还提供了利用米曲霉(Aspergillusoryzae)LCCC30141生产中性蛋白酶的方法，该方法包括将米曲霉(Aspergillusoryzae)LCCC30141进行发酵培养，得粗酶液的步骤。优选的，所述发酵培养为液体发酵培养或固体发酵培养。液体发酵培养的条件：接种量为105-107cfu/ml，发酵温度为20～40℃，时间为2～4d，所得发酵液为粗酶液；优选的，接种量为106cfu/ml，发酵温度为30℃，时间为3d；优选的，所述发酵培养为通风培养，通风量为1:0.4～0.6V/V·min；优选的，通风量为1:0.5V/V·min；优选的，液体发酵培养所用的液体发酵培养基含有：麸皮粉30g/L、酵母膏5g/L、玉米浆10g/L、硫酸铵1g/L、磷酸氢二钠2g/L，pH6.5-7.0。优选的，所述固体发酵培养采用三级发酵工艺，具体包括以下步骤：(1)在斜面PDA培养基上培养米曲霉LCCC30141菌种，得到菌悬浮液；(2)将菌悬浮液接种于液体菌种培养基上扩大培养，得到种子液；(3)将种子液以105-107cfu/g接种于固体培养基，温度20～40℃培养2～4d，加入生理盐水浸提后，抽滤，所得滤液为粗酶液；优选的，PDA培养基含有：土豆200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L；和/或液体菌种培养基含有：麸皮粉30g/L、酵母膏5g/L、玉米浆10g/L、硫酸铵1g/L、磷酸氢二钠2g/L，pH6.5-7.0；和/或固体培养基含有：麸皮40％、豆粕10％、磷酸氢二钠0.1％、硫酸镁0.05％、硫酸铵0.2％；进一步的，该方法还包括在粗酶液中加入硫酸铵沉淀，沉淀溶解后经透析、离心、冷冻干燥后，得酶粉的步骤。优选的，硫酸铵的饱和度为60～80％；优选的，离心的温度为0～4℃，转速为5000～8000r/min，时间为10～30min。另一方面，本专利技术还提供了米曲霉(Aspergillusoryzae)LCCC30141或所述的方法在烟叶发酵中的应用。另一方面，本专利技术还提供了一种烟叶发酵方法，在烟叶中接种米曲霉(Aspergillusoryzae)LCCC30141进行发酵。优选的，米曲霉(Aspergillusoryzae)LCCC30141的接种量为105～107cfu/g，发酵的温度为20～40℃，湿度为40～70％，时间为5～10d。本专利技术的有益效果为：本专利技术公开了米曲霉(Aspergillusoryzae)LCCC30141能够产生高酶活性的中性蛋白酶，为中性蛋白酶的生产来源提供了一个新的途径，可以实现中性蛋白酶的规模化生产；将具有产高酶活力的中性蛋白酶的黑曲霉应用到烟叶发酵中，能够加速烟叶中蛋白质的分解，明显缩短烟叶的发酵周期，提升烟叶的品质。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行详细说明，以下实施例仅为方便本领域技术人员理解本专利技术技术方案，实现或使用本专利技术所做的说明，并不以此限定本专利技术的保护范围。本专利技术中，如未指定，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。本专利技术使用的米曲霉(Aspergillusoryzae)菌株购于辽宁省微生物菌种保藏中心，编号为：LCCC30141。实施例中的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。实施例1利用米曲霉LCCC30141发酵生产中性蛋白酶米曲霉LCCC30141液体发酵工艺综合单因素多水平、多因素多水平正交试验结果，确定米曲霉LCCC30141的液体发酵工艺：菌种制备：将斜面菌种用无菌水制成孢子悬液，孢子悬液菌数为107cfu/mL。液体培养基：培养基配方为麸皮粉30g/L、酵母膏5g/L、玉米浆10g/L、硫酸铵1g/L、磷酸氢二钠2g/L，pH6.5-7.0，培养基装量为罐体容积的75％。发酵罐培养基灭菌：121℃，2h。接种：利用火焰圈无菌接种，接种量为10％。液体培养：培养温度30℃，通风培养60-65h，搅拌速度180rpm，通风量为1:0.5(v/v·min)。米曲霉(Aspergillusoryzae)LCCC30141固体发酵工艺米曲霉(Aspergillusoryzae)LCCC30141固体发酵工艺采用三级发酵工艺：斜面菌种—液体菌种—固体培养。(1)斜面菌种：采用PDA培养基，培养72h。(2)液体菌种：培养基配方为：麸皮粉30g/L、酵母膏5g/L、玉米浆10g/L、硫酸铵1g/L、磷酸氢二钠2g/L，pH6.5-7.0。通风培养48-50h，通风量为1:0.5(V/V·min)。(3)固体培养：培养基配方为：将麸皮与豆粕按4:1比例混匀后，按照1：1的质量加入蒸馏水，每1000g固体培养基中加入磷酸氢二钠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.米曲霉(Aspergillus oryzae)LCCC30141在生产中性蛋白酶中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.米曲霉(Aspergillusoryzae)LCCC30141在生产中性蛋白酶中的应用。


2.利用米曲霉(Aspergillusoryzae)LCCC30141生产中性蛋白酶的方法，其特征在于，该方法包括将米曲霉LCCC30141进行发酵培养，得粗酶液的步骤。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养为液体发酵培养或固体发酵培养。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，液体发酵培养的条件：接种量为105-107cfu/ml，发酵温度为20～40℃，时间为2～4d，所得发酵液为粗酶液；
优选的，接种量为106cfu/ml，发酵温度为30℃，时间为3d；
优选的，所述发酵培养为通风培养，通风量为1:0.4～0.6V/V·min；
优选的，通风量为1:0.5V/V·min；
优选的，液体发酵培养所用的液体发酵培养基含有：麸皮粉30g/L、酵母膏5g/L、玉米浆10g/L、硫酸铵1g/L、磷酸氢二钠2g/L，pH6.5-7.0。


5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述固体发酵培养采用三级发酵工艺，具体包括以下步骤：
(1)在斜面PDA培养基上培养米曲霉(Aspergillusoryzae)LCCC30141菌种，得到菌悬浮液；
(2)将菌悬浮液接种于液体菌种培养基上扩大培养，得到种子液；
(3)将种子液以105-107cfu/g...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶亚军，张庆华，田数，赵新海，陈晨，陈飞，张永岗，于宏男，刘月明，王旭东，李力群，乔月梅，
申请(专利权)人：内蒙古昆明卷烟有限责任公司，
类型：发明
国别省市：内蒙;15