一种大规模培养CHO细胞以制备乙型肝炎疫苗的方法技术

本发明专利技术公开了一种大规模培养CHO细胞以制备乙型肝炎疫苗的方法。该方法包括细胞重组、细胞增殖、灌流培养、对收获的培养液进行浓缩富集、纯化、纯化液加入甲醛处理、半成品配制以及半成品经分装后获得成品。其中灌流培养具体是：当细胞密度增殖到2×10

A method of preparing hepatitis B vaccine by culturing CHO cells in large scale

【技术实现步骤摘要】
一种大规模培养CHO细胞以制备乙型肝炎疫苗的方法
本专利技术涉及了疫苗制作领域，具体的是一种大规模培养CHO细胞以制备乙型肝炎疫苗的方法。
技术介绍
现有乙肝疫苗有酵母乙肝疫苗和CHO细胞乙肝疫苗两种。两种疫苗都是利用现代生物技术进行的基因重组生物制品。酵母重组乙肝疫苗是一种包含有HBsAg亚单位疫苗，是利用现代生物学技术将HBsAg基因克隆至酵母中，通过培养重组酵母来表达乙肝表面抗原。酵母系统虽然有表达量高成本低的优势，但是存在表达系统产生的HBsAg无糖基化的缺点，同时不能外分泌，产物的分离纯化比较困难。CHO细胞乙肝疫苗是将HBsAg基因克隆至CHO细胞中，通过培养重组CHO细胞来表达乙肝表面抗原。其表达产生的HBsAg更接近天然的HBsAg，产物的分离纯化也比较简单。但哺乳动物细胞对培养条件的要求都很高，现有的生产工艺是利用转瓶进行的培养工艺，存在效率低、成本高、容易污染的风险。
技术实现思路
为了克服现有技术中的缺陷，本专利技术实施例提供了一种大规模培养CHO细胞以制备乙型肝炎疫苗的方法，所述方法包括以下步骤,S1.细胞重组：提供带有HBsAg抗原序列的重组CHO细胞，并在培养环境温度为35℃～38℃的情况下对所述重组CHO细胞进行传代递增，培养时间为2天-6天；S2.细胞增殖：将所述重组CHO细胞按1×105～1×106cells/ml的浓度转入生物反应器继续进行培养，重组CHO细胞生物反应器继续增殖，培养条件为温度35℃～38℃，溶氧量30％～90％，pH值6.8～7.4；S3.灌流培养：当细胞密度增殖到2×106cells/ml以上时，更换维持液进行灌流培养，灌流培养时，不断补充新的维持液，同时收集细胞培养液；灌流培养的培养条件为温度30℃～38℃，溶氧量30％～90％，pH值7.0～7.6。S4.培养液浓缩：对收获的培养液进行浓缩富集，获得收获液；S5.收获液纯化：对收获液进行纯化，获得纯化液；S6.纯化液加入甲醛处理：将甲醛加入至纯化液中并充分混合，保持温度为2℃～37℃，处理时间为72-120小时，再经超滤、浓缩、除菌过滤获得HBsAg抗原液获得HBsAg抗原液；S7.半成品制作：首先将HBsAg抗原液经适当稀释，然后加入氢氧化铝获得半成品；S8.半成品经分装后，获得成品，每次人用剂量为0.5ml或1.0ml，含HBsAg10μg或20μg。进一步地，所述维持液为含2％～8％牛血清适宜细胞贴壁生长的培养基。进一步地，所述维持液为不含血清适宜细胞悬浮生长的培养基。进一步地，所述收获液纯化的方法为蛋白沉淀、浓缩、超速离心、离子交换、疏水和凝胶色谱中的一种或多种组合。进一步地，所述培养液浓缩方法为超滤。进一步地，所述半成品含有不高于0.43mg/ml铝含量的氢氧化铝。进一步地，所述加入甲醛的浓度为50～200μg/ml。进一步地，所述培养基为MEM培养基、199培养基、DMEM培养基和1640培养基中的一种。进一步地，所述培养基为1640培养基、DMEM培养基、SFM培养基中的一种。本专利技术的有益效果如下：本专利技术采用生物反应器高密度培养，培养后的细胞密度可以达到1.5×107cells/ml，活率大于98％，收获液对应的HBsAg抗原产量可达到15mg/L以上，比现行转瓶工艺提高50％以上，从而提高重组乙型肝炎疫苗的生产效率，克服现有技术中生产效率低的缺陷；同时，克服了转瓶工艺的需对多数量培养瓶反复操作而产生的易污染风险。为让本专利技术的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术一种大规模培养CHO细胞以制备乙型肝炎疫苗的方法的实施步骤图；图2是本专利技术实施例中的产品的检测结果图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。参照图1和图2，在本专利技术第一种实施例中的一种大规模培养CHO细胞以制备乙型肝炎疫苗的方法，包括以下步骤,S1.细胞重组：提供带有HBsAg抗原序列的重组CHO细胞，并在培养环境温度为35℃的情况下对所述重组CHO细胞进行传代递增，培养时间为6天。S2.细胞增殖：将所述重组CHO细胞按5×105cells/ml的浓度转入生物反应器继续进行培养，重组CHO细胞生物反应器继续增殖，培养条件为：温度36℃，溶氧量60％，pH值6.8；S3.灌流培养：当细胞密度增殖到1×107cells/ml以上时，更换维持液进行灌流培养，灌流培养时，不断补充新的维持液，同时收集细胞培养液。灌流培养的培养条件为，温度30℃，溶氧量30％，pH值7.0。在实际实施过程中，维持液为含2％～8％牛血清适宜细胞贴壁生长的培养基。培养基根据实际需要选用MEM培养基、199培养基、DMEM培养基和1640培养基中的一种。经测定，测定结果参考图2，培养液中HBsAg抗原的浓度达到16.5mg/L。S4.培养液浓缩：对收获的培养液进行浓缩富集，获得收获液；培养液采用硫酸铵沉淀杂蛋白后，采用超滤等方式对培养液进行浓缩处理，从而提高收获的收获液中的HBsAg抗原的浓度。S5.收获液纯化：对收获液进行纯化，获得纯化液并对纯化液进行检定，检定结果如图2；在实际实施的过程中，为了提高对收获液的纯化效果，收获液纯化的方法根据实际采用超速离心和凝胶色谱2种的组合。S6.纯化过程中加入甲醛处理：将甲醛加入至纯化液中并充分混合，保持温度为2℃，处理时间为120小时以使得甲醛与纯化液充分混合，获得HBsAg抗原原液，并对获得的HBsAg抗原原液进行测定，测定结果参考图2；其中甲醛的加入量为200μg/ml。再经超滤、浓缩、除菌过滤获得HBsAg抗原液。S7.半成品配制：首先将HBsAg抗原原液经适当稀释，然后加入的氢氧化铝获得半成品；半成品中氢氧化铝中的铝含量为0.39mg/ml。S8.半成品经分装后，获得成品，并对成品进行测定，测定结果，每次人用剂量为0.5ml或1.0ml，含HBsAg10μg或20μg。参照图1和图2，在本专利技术第二种实施例中的一种大规模培养CHO细胞以制备乙型肝炎疫苗的方法，包括以下步骤,S1.细胞重组：提供带有HBsAg抗原序列的重组CHO细胞，并在培养环境温度为36.5℃的情况下对所述重组CHO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大规模培养CHO细胞以制备乙型肝炎疫苗的方法，所述方法包括以下步骤,/nS1.细胞重组：提供带有HBsAg抗原序列的重组CHO细胞，并在培养环境温度为35℃～38℃的情况下对所述重组CHO细胞进行传代递增，培养时间为2天-6天，培养方式为贴壁培养或者悬浮培养；/nS2.细胞增殖：将所述重组CHO细胞按1×10

【技术特征摘要】
1.一种大规模培养CHO细胞以制备乙型肝炎疫苗的方法，所述方法包括以下步骤,
S1.细胞重组：提供带有HBsAg抗原序列的重组CHO细胞，并在培养环境温度为35℃～38℃的情况下对所述重组CHO细胞进行传代递增，培养时间为2天-6天，培养方式为贴壁培养或者悬浮培养；
S2.细胞增殖：将所述重组CHO细胞按1×105～1×106cells/ml的浓度转入生物反应器继续进行培养，重组CHO细胞生物反应器继续增殖，培养条件为温度35℃～38℃，溶氧量30％～90％，pH值6.8～7.4；
S3.灌流培养：当细胞密度增殖到2×106cells/ml以上时，更换维持液进行灌流培养，培养条件为温度30℃～38℃，溶氧量30％～90％，pH值7.0～7.6，灌流培养时，不断补充新的维持液，同时收集细胞培养液；
S4.培养液浓缩：对收获的培养液进行浓缩富集，获得收获液；
S5.收获液纯化：对收获液进行纯化，获得纯化液；
S6.纯化液加入甲醛处理：将甲醛加入至纯化液中并充分混合，保持温度为2℃～37℃，处理时间为72-120小时，再经超滤、浓缩、除菌过滤获得HBsAg抗原液；
S7.半成品配制：首先将HBsAg抗原原液液经适当稀释，然后加入氢氧化铝获得半成品；
S8.半成品经分装后，获得成品，每次人用剂量为0.5ml或1.0ml，含HBsAg10μg或20μg。


2.根据权利要求1所述的大规模...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵永强，
申请(专利权)人：苏州百奥思达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32