一种参与聚合延伸的寡核苷酸链探针及其核酸扩增试剂盒制造技术

本实用新型专利技术公开了一种参与聚合延伸的寡核苷酸链探针，寡核苷酸链探针的最小自由能结构是茎环结构，其序列自5’端至3’端依次为如下四区段：茎结构序列MB‑J、环序列MB‑H、茎结构互补序列MB‑Jc、单链尾序列MB‑P；一组荧光淬灭基团和荧光基团分别连接在MB‑J的5’端和MB‑Jc链中间碱基，两连接位置在茎环结构中相邻近；MB‑H和MB‑P与靶序列全部或部分互补，且MB‑P的3’端与靶序列互补并能延伸聚合。本实用新型专利技术的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针，具有引物和分子信标的功能。本实用新型专利技术还公开了一种恒温核酸扩增试剂盒，包括所述的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针。

A probe of oligonucleotide chain involved in polymerization and extension and its nucleic acid amplification kit

【技术实现步骤摘要】
一种参与聚合延伸的寡核苷酸链探针及其核酸扩增试剂盒
本技术属于生物工程领域，具体地说，是关于一种参与聚合延伸的寡核苷酸链探针及其核酸扩增试剂盒。
技术介绍
DNA特异性扩增技术和检测技术，和在此基础上发展的各种应用发展迅猛。在临床检验中，即时检验(point-of-caretesting，POCT)理念快速兴起，从简单的干化学技术到传感及生物芯片，其检测项目几乎覆盖了所有医学检验领域。POCT与核酸扩增的结合要求仪器便携稳定、方法操作简便、获得结果快速清楚可靠甚至具有可对比的标准。由此产生了方法、试剂、仪器等大量的改进和技术。POCT中大量应用等温DNA扩增技术，包括链置换等温扩增(stranddisplacementamplification，SDA)、滚环等温扩增(rollingcircleamplification，RCA)、核酸序列扩增技术(nucleicacidsequencebasedamplification，NASBA)、环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)、交叉引物介导的等温扩增(Cross-PrimingAmplification，CPA)等。等温DNA扩增反应技术因不需要定时周期变化反应温度，降低了对仪器的要求，促进DNA扩增为基础的检测技术的广泛应用；高速的扩增酶和扩增循环启动不受温度循环限制大大缩短的扩增所需的时间。但是，几乎所有等温扩增反应都倾向于产生非特异的DNA合成，引入探针的好处包括不产生非特异的信号和信号检测灵敏便捷。现有的恒温扩增技术如LAMP技术多采用观测焦磷酸镁白色沉淀、HNB染料颜色、钙黄绿素荧光等方法判断阳性，但上述方法的阳性检测结果只能代表实验过程中发生了核酸聚合反应过程，而无法区分真正的由引物和对应目标DNA模版杂交而形成的阳性扩增结果和由于引物之间、引物与样本DNA之间误杂交发生误扩增所导致的假阳性结果，对临床检测造成了不便。分子信标(molecularbeacon)是1996年Tyagi等技术的一种有茎环结构的荧光探，应用于循环变温的聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction,PCR)扩增，使其检测达到定量的精密度。该技术具有极高的特异性，而且操作简便、灵敏度高，特别是它可以进行实时定量检测、甚至可以用于活体分析。分子信标的茎结构两链相邻近的位置(常见为茎的两端或环的两端，在茎结构的任一位置也是可以的)一个连接有荧光基团，另一个连接有荧光淬灭基团。当没有靶序列存在时，分子信标探针低温时自身闭合，荧光基团和淬灭基团相互靠近而不发荧光。在有靶序列存在的情况下，分子信标低温时与互补的靶序列形成稳定的双链杂交体，使荧光基团和淬灭基团分离，发出荧光，随着温度的升高，双链杂交体逐渐解链，达到熔点时，荧光迅速下降。通过控制反应温度同时观测荧光值，即可判断是否存在靶序列的扩增。在PCR扩增的退火阶段，分子信标与生成的靶序列结合发出荧光，在延伸阶段，脱离靶序列而不干扰扩增，随着循环次数的增加，与模板结合的分子信标的量亦增加，最终的荧光强度与扩增的模板量成正比。从而实现了实时监控的定量的高度灵敏和特异的检测。分子信标也应用于包括PCR在内的其它DNA扩增技术的检测。常规的分子信标环序列与靶序列一致，茎序列多为高GC比例的无关序列。中国专利申请201811067779.3公开了一种基于分子信标的荧光环介导等温扩增方法，该方法根据环介导等温扩增技术(LAMP)环引物(加速引物)设计分子信标，一个末端连接有荧光基团，另一个末端连接有荧光淬灭基团。该反应体系的检测限约为103拷贝。这个方法能够产生特异的分子信标荧光信号，能够区别背景和阳性，但是该方法的扩增终点信号强度Rn较差(0.5vs染料法>2)，信号弱，不适合用作商品化的试剂盒。
技术实现思路
为了解决上述问题，本技术在传统的分子信标茎环序列外，将其3'端的茎额外延伸出来一定长度序列作为尾链，且这段尾链序列与靶序列互补，尾链能参与正常的聚合延伸；这种情况下，该分子信标不只是一个荧光信号探针，它也是参与聚合延伸提高核酸扩增反应效率的一个特殊引物。因此，本技术的第一个目的是提供一种参与聚合延伸的寡核苷酸链探针，以解决现有核酸扩增反应中存在的基因扩增中的序列特异性荧光信号来源问题。本技术的第二个目的是提供一种核酸扩增试剂盒。为实现上述目的，本技术采用如下技术方案：作为本技术的第一个方面，一种参与聚合延伸的寡核苷酸链探针，寡核苷酸链探针的最小自由能结构是茎环结构，其序列自5’端至3’端依次为如下四区段：茎结构序列MB-J、环序列MB-H、茎结构互补序列MB-Jc、单链尾序列MB-P；MB-J的碱基侧面和MB-Jc的碱基侧面的茎环结构中两个邻近位置分别连接了一组荧光淬灭基团/荧光基团中的一个；MB-H和MB-P与靶序列全部或部分互补，且MB-P的3’端与靶序列互补并能延伸聚合。当茎环结构打开，MB-J与MB-Jc分离，远离淬灭基团的荧光基团发出的信号可以被检测到。检测到荧光信号即等同于茎环结构被打开，茎环结构被打开的情况为：当茎或环的序列与靶序列互补时，即存在单链的靶序列；当仅尾序列MB-P与靶序列互补时，该寡核苷酸链探针所延伸的DNA充当下一轮延伸的模板并延伸到探针的位置。根据本技术，茎序列MB-Jc的序列全部或部分与靶序列互补。进一步的，所述参与聚合延伸的寡核苷酸链探针为RNA或DNA。作为本技术的第二个方面，一种核酸扩增试剂盒，包括根据靶序列设计的引物，至少一种链置换DNA聚合酶或一种RNA聚合酶以及如上述所述的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针。根据本技术，所述的核酸扩增试剂盒包括至少一种链置换DNA聚合酶及与靶序列互补的四条按环介导等温扩增(LAMP)方法设计的引物；这四条引物分别为F3、FIP、BIP、B3，靶序列上存在与FIP、BIP相关的F1c/B1序列，其中，上述所述的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针的序列全部或部分与靶序列上F1c的3’端上游序列相同或B1的5’端下游的序列互补，或参与聚合延伸的寡核苷酸链探针的序列来自靶序列以外来源，共同完成LAMP反应。根据本技术，所述核酸扩增试剂盒包括至少一种链置换DNA聚合酶及与靶序列互补的至少一条按滚环扩增(rollingcycleamplification,RCA)方法设计的引物，上述所述的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针的序列全部或部分与靶序列上互补或相同，共同完成双引物滚环扩增(又称，超支化滚环扩增Hyperbranchedrollingcycleamplification或分支滚环扩增ramificationamplification)反应。根据本技术，所述核酸扩增试剂盒包括至少一种链置换DNA聚合酶及与靶序列互补的至少两条引物分别为F/R，寡核苷酸链探针的序列全部或部分与靶序列上除F/R以外的其他序列互补或相同。进一步的，所述核酸扩增试剂盒包括至少一种链置本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种参与聚合延伸的寡核苷酸链探针，其特征在于，寡核苷酸链探针的最小自由能结构是茎环结构，其序列自5’端至3’端依次为如下四区段：茎结构序列MB-J、环序列MB-H、茎结构互补序列MB-Jc、单链尾序列MB-P；一组荧光淬灭基团和荧光基团分别连接在MB-J的5’端和MB-Jc链中间碱基，两连接位置在茎环结构中相邻近；MB-H和MB-P与靶序列全部或部分互补，且MB-P的3’端与靶序列互补并能延伸聚合。/n

【技术特征摘要】
1.一种参与聚合延伸的寡核苷酸链探针，其特征在于，寡核苷酸链探针的最小自由能结构是茎环结构，其序列自5’端至3’端依次为如下四区段：茎结构序列MB-J、环序列MB-H、茎结构互补序列MB-Jc、单链尾序列MB-P；一组荧光淬灭基团和荧光基团分别连接在MB-J的5’端和MB-Jc链中间碱基，两连接位置在茎环结构中相邻近；MB-H和MB-P与靶序列全部或部分互补，且MB-P的3’端与靶序列互补并能延伸聚合。


2.如权利要求1所述的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针，其特征在于，MB-Jc的序列全部或部分与靶序列互补。


3.如权利要求1所述的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针，其特征在于，参与聚合延伸的寡核苷酸链探针为RNA或DNA。


4.一种核酸扩增试剂盒，包括根据靶序列设计的引物，其特征在于，还包括至少一种链置换DNA聚合酶以及如权利要求1或2所述的参与聚合延伸的寡核苷酸链探针。


5.如权利要求4所述的核酸扩增试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括至少一种链置换DNA聚合酶及与靶序列互补的四条按环介导等温扩增方法设计的引物；这四条引物分别为F3、FIP、BIP、B3，靶序列上存在与FIP、BIP相关的F1c/B1序列，其中寡核苷酸链探针的序列全部或部分与靶序列上F1c的3’端上游序列相同或与靶序列上B1的5...

【专利技术属性】
技术研发人员：周中人，许向华，张磊，张桂平，
申请(专利权)人：上海快灵生物科技有限公司，上海快灵生物工程有限公司，
类型：新型
国别省市：上海;31