一种重组蛋白糖谱分析方法技术

本发明专利技术公开了一种重组蛋白糖谱分析方法，包括如下步骤：S1、配制溶液，具体包括S101、配制蛋白质变性液，S102、配制PNGase F溶液；S103、配制Triton X‑100溶液。本发明专利技术利用糖谱分析研究，来反映糖蛋白的修饰情况和批间一致性；建立一种基于HPLC‑HILIC的N连接糖糖谱分析方法，用于质控此样品N连接糖糖基化修饰的批间一致性。本发明专利技术中样品预处理根据样品中的蛋白浓度进行不同处理，便于后续试验分析同时提高分析准确度。本发明专利技术中进一步提出了去除多余的2‑AB标记液的方法，有效去除多余2‑AB标记液，进一步保证分析准确性；本发明专利技术进一步采用UPLC分析中利用乙腈平衡系统至基线平稳，用下述的洗脱条件平衡色谱柱一针再进样分析，进一步提高分析准确性。

A method of glycoprofile analysis of recombinant protein

【技术实现步骤摘要】
一种重组蛋白糖谱分析方法
本专利技术属于蛋白糖谱分析
，具体为一种重组蛋白糖谱分析方法。
技术介绍
糖蛋白是一类高度复杂且具有明显异质性的大分子，其中糖基化异质性是其固有特性，影响其生物活性、蛋白构象、稳定性、可溶性、药代动力学和免疫原性，最终影响其安全性、有效性和半衰期。重组人红细胞生成素(Fc)融合蛋白是利用基因工程技术，将EPO基因融合Fc基因片段后转入CHO细胞内，高效表达一种高度复杂的糖蛋白，用于治疗慢性肾功能衰竭和癌症化疗引起的贫血等。理论上这个蛋白有4个N连接糖基化位点。糖的完整性直接影响此蛋白在人体内的代谢稳定性和生物学活性，而完整的糖修饰多以唾液酸结束，已有研究表明，唾液酸化程度与此蛋白的活性呈正比关系，EPO四天线糖型含量的增加能显著增强EPO在老鼠体内的生物活性。对于重组糖蛋白药物的质量研究和控制，近年来EMA、ICH、CFDA等先后出台相应的指导文件，提出需要对糖蛋白进行糖基化鉴定和修饰程度质控。在我国早期的细胞因子类(如EPO)的研究中，主要通过质控唾液酸的含量来间接反映其糖基化修饰程度；而随着技术的进步本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组蛋白糖谱分析方法，其特征在于：包括如下步骤：/nS1、配制溶液，包括S101、配制蛋白质变性液；/nS102、配制PNGase F溶液；/nS103、配制Triton X-100溶液；/nS104、配制酶切缓冲液；/nS105、配制甲酸铵溶液；/nS2、样品检测，包括S201、样品预处理；/nS202、糖链的酶切处理：离心管中加入50μL上述得到的蛋白溶液、100μL酶切缓冲液和10μL蛋白变性液，混匀后沸水浴10min，室温冷却5min，加入10μL 15％Triton X100，混匀再加入8μL 250U/mL的PNGase F，混匀后37℃恒温箱中酶切2h；/nS203、除蛋...

【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白糖谱分析方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、配制溶液，包括S101、配制蛋白质变性液；
S102、配制PNGaseF溶液；
S103、配制TritonX-100溶液；
S104、配制酶切缓冲液；
S105、配制甲酸铵溶液；
S2、样品检测，包括S201、样品预处理；
S202、糖链的酶切处理：离心管中加入50μL上述得到的蛋白溶液、100μL酶切缓冲液和10μL蛋白变性液，混匀后沸水浴10min，室温冷却5min，加入10μL15％TritonX100，混匀再加入8μL250U/mL的PNGaseF，混匀后37℃恒温箱中酶切2h；
S203、除蛋白和干燥：将酶切完成的溶液加入至10k超滤离心管中，14000×g离心30分钟，收集过滤液约130μL并转移至1.5mL的洁净EP管中，室温下真空离心干燥2h；
S204、2-AB标记液的配制：取700μLDMSO至1.5mL洁净离心管中，加入300μL冰醋酸，漩涡混匀得到标记缓冲液，加入到50mg2-AB中，漩涡混匀，待完全溶解后，再加入到63mg氰基硼氢化钠中，漩涡混匀至完全溶解，即为2-AB标记液，避光保存，一个小时内使用；
S205、糖链的衍生：取10μL新配制的2-AB标记液加入至干燥糖链中，振动混匀至均一的乳白色溶液，多层封口膜封住管口置于65℃烘干箱中衍生2h，衍生结束室温冷却3分钟后加入190μL去离子水混匀用于下步；
S206、去除多余的2-AB标记液；
S207、UPLC分析：按照UPLC设备操作规程，灌注完成后，用25％水：75％乙腈平衡系统15min，流速0.1ml/min，接上色谱柱，用25％水：75％乙腈冲洗色谱柱约5min，流速0.3ml/min，再切换至起始条件，25％流动相A：75％乙腈，平衡1～1.5h至基线平稳，用下述的洗脱条件平衡色谱柱一针再进样分析；
S3、数据处理及结果判断：包括S301、确定积分条件积分得到糖谱，峰宽20，阈值32，最小峰面积60000，积分时间为5～60分钟，共积分14个峰，RT窗口15.00％，更新RT为平均所有峰的保留时间参比和相对保留时间参比均为峰3，峰匹配除了峰3为最大面积，其余峰的峰匹配均为最接近的；S302、结果判断，在检测待检样品时，应同时处理对照品作为质控；在规定的积分条件下，对照品应积到14个目标峰，用归一化法计算各峰面积占14个峰总面积的比例，若各峰面积的比例％符合相应糖谱标准，实验结果成立，否则应重检；样品结果与对照品一致且符合下表规定，判为合格；



S4、检测后处理：在试验结束后应切换50％水溶液冲洗系统后再用85％乙腈保存色谱柱和UPLC系统；每次使用完后拆下色谱柱，接上配套的PEEK头，置于阴凉处妥善保存；用两通连接设备管路。


2.如权利要求1所述的一种重组蛋白糖谱分析方法，其特征在于：所述S101中配制蛋白质变性液，称取0.02g十二烷基胺磺酸钠溶解于10mL超纯水中，再加入71μLβ-巯基乙醇，混匀，4℃保存备用。


3.如权利要求1所述的一种重组蛋白糖谱分析方法，其特征在于：所述S102中配制PNGaseF溶液，先将装50U，粉末状的PNGaseF于棕色玻璃瓶正立状态轻...

【专利技术属性】
技术研发人员：程玉，兰万军，陈静山，茹帅英，张桂涛，林如新，
申请(专利权)人：东莞太力生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44