本发明专利技术提供一种大豆GmHsps_p23‑like基因及其应用，属于植物基因工程领域。该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明专利技术利用RT‑PCR技术克隆大豆GmHsps_p23‑like基因，成功重组了含有草铵膦筛选标记的该基因植物表达载体：pCAMBIA3301‑GmHsps_p23‑like和CRISPR/Cas9‑GmHsps_p23‑like。通过农杆菌介导大豆子叶节法，将两套植物表达载体对大豆进行遗传转化。干旱胁迫鉴定结果表明，本发明专利技术的GmHsps_p23‑like基因的表达可提高大豆的抗旱能力。
Gmhsps_p23 like gene and its application in Soybean
【技术实现步骤摘要】
大豆GmHsps_p23-like基因及其应用
本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及一种大豆GmHsps_p23-like基因及其应用。
技术介绍
大豆的生长过程中，对水的需求量多，干旱严重影响大豆的产量，我国每年因为干旱对大豆产量和品质造成的损失不可估量。作为粮食主产区，东北地区大豆的种植受极端气候事件影响大，特别是高温干旱影响大豆的生产。通过转基因技术提高植物抗旱性，具备并己展现了巨大的应用价值和经济价值。克隆与抗旱性高效相关的基因，并将其转入到基因组中是培育大豆抗旱品种的最有效方法之一。小热激蛋白(Smallheatshockproteins,sHsps或Hsp20)是一类低分子量的热激蛋白(12-40kDa)。植物中的sHsps在序列相似性，细胞定位和生物学功能方面比其他Hsps家族更加多样化，在外界环境不利条件下，尤其是热胁迫刺激时sHsps会大量合成，结构保守的sHsps具有分子伴侣的功能，在保护植物免受胁迫和重建细胞稳态方面起着至关重要的作用。植物sHsps可以应对各种环境压力，包括热，冷，干旱，盐度和氧化胁迫，sHsps还与类囊体膜相互作用，参与植物抗逆。在石竹中已有叶绿体sHsps重要性的相关报道。研究发现玉米线粒体sHsps(msHsp)在盐胁迫期间显示出保护NADH，改善线粒体电子传递的作用。过表达sHsps可以减轻番茄对盐胁迫的耐受性，桑树内质网sHsps的积累可以增强其对寒冷胁迫的耐受性等。越来越多的研究表明，sHsps的积累与植物对压力耐受性之间存在很强的相关性]。CRISPR/Cas9是由细菌和古细菌进化而来的一种获得性免疫防御机制，可以应对病毒和质粒的不断攻击。近年来CRISPR/Cas9(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)介导的基因编辑技术日渐成熟，已成为生命科学领域表较新颖热门的技术之一。2017年，禹明森等(禹明森,李翔,高马也,etal.生菜CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立[J],2017,(4):736-746.)以生菜为研究对象，建立了生菜的CRISPR/Cas9基因编辑体系。Zhang等(ZhangJ,ZhangH,BotellaJR,etal.GenerationofnewglutinousricebyCRISPR/Cas_9-targetedmutagenesisoftheWaxygeneinelitericevarieties[J],2018,60(5):369-375.)利用CRISPR/Cas9系统对粳稻品种的Waxy基因进行编辑，在不影响其他理想的农艺性状的前提下，使粳稻转化为糯稻，为改善优秀作物品种提供了一个有效和简便的策略。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种大豆GmHsps_p23-like基因及其应用，该GmHsps_p23-like基因的表达可提高大豆的抗旱能力。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术首先提供一种大豆GmHsps_p23-like基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供编码上述大豆GmHsps_p23-like基因的氨基酸序列，如SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供含有上述大豆GmHsps_p23-like基因的植物超表达载体，所述的超表达载体命名为pCAMBIA3301-GmHsps_p23-like。本专利技术还提供含有上述大豆GmHsps_p23-like基因的植物基因编辑载体，所述的基因编辑载体命名为CRISPR/Cas9-GmHsps_p23-like。本专利技术还提供上述大豆GmHsps_p23-like基因在植物抗旱中的应用。本专利技术的有益效果本专利技术提供一种大豆GmHsps_p23-like基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，本专利技术利用RT-PCR技术克隆大豆GmHsps_p23-like基因，成功重组了含有草铵膦筛选标记的该基因植物表达载体：pCAMBIA3301-GmHsps_p23-like和CRISPR/Cas9-GmHsps_p23-like。通过农杆菌介导大豆子叶节法，将两套植物表达载体对大豆进行遗传转化。PCR检测结果显示两套载体分别获得3株和2株T1代阳性植株，6株和4株T2代阳性植株。T2代转超表达载体pCAMBIA3301-GmHsps_p23-like大豆植株经SouthernBloting检测结果显示，外源基因以单拷贝形式插入到基因组中，T2代转基因编辑载体CRISPR/Cas9-GmHsps_p23-like大豆植株目的基因测序分析发现，目的基因被进行了编辑。荧光定量PCR结果显示，GmHsps-p23-like基因在转超表达载体植株中表达量有所上升，而在转基因编辑载体植株中表达量下降不显著。干旱胁迫鉴定结果表明，GmHsps_p23-like基因的表达可提高大豆的抗旱能力。附图说明图1为植物超表达载体的T-DNA结构示意图；图2为RNA提取凝胶电泳图，1-4：大豆叶片总RNA；图3为GmHsps_p23-like基因的克隆检测图；M：DL2000分子量标准；N：阴性对照；1-4：RT-PCR产物；图4为克隆载体PCR鉴定电泳图，M：DL2000分子量标准；N：阴性对照；1-2：PCR产物；图5为克隆载体双酶切验证图，M：DL2000分子量标准；1：克隆载体质粒；2-3：双酶切产物；图6为表达载体pCAMBIA3301的酶切检测图，M：DL2000分子量标准；1：载体质粒；2-5：双酶切产物；图7为超表达载体pCAMBIA3301-GmHsps_p23-like的PCR鉴定电泳图，M：DL2000分子量标准；P：阳性对照；N：阴性对照；1-5：PCR产物；图8为超表达载体pCAMBIA3301-GmHsps_p23-like的双酶切鉴定图，M：DL2000分子量标准；1：质粒；2-3：双酶切产物；图9为CRISPR/Cas9-GmHsps_p23-like载体PCR鉴定电泳图，M：DL2000分子量标准；N：阴性对照；1-4：PCR产物；a：Bar基因；b：启动子35s图10为CRISPR/Cas9-GmHsps_p23-like载体测序结果比对图；图11为转化植株Bar基因的检测图；M：DL2000分子量标准P：阳性对照N：阴性对照1-17：PCR产物；a-1：T0代转超表达载体植株PCR检测结果；a-2：T0代转CRISPR/Cas9载体植株PCR检测结果；b-1：T1代转超表达载体植株及PCR检测结果；b-2：T1代转CRISPR/Cas9载体植株PCR；c-1：T2代转超表达载体植株PCR检测结果；c-2：T2代转CRISPR/Cas9载体植株PCR检测结果；图12为T2代转超表达载体pCAMBIA3301-GmHsps_p23-like大豆植株的SouthernBloting检测本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种大豆GmHsps_p23-like基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种大豆GmHsps_p23-like基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.编码权利要求1所述的大豆GmHsps_p23-like基因的氨基酸序列，其特征在于，如SEQIDNO.2所示。
3.含有权利要求1所述的大豆GmHsps_p23-like基因的植物超表达载体，其特征在于，所述的超表达...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘思言，李广隆，鲁中爽，关淑艳，曲静，姚丹，王蕊，刘金凤，刘明明，李远强，幺梦凡，张桐禹，任萍，边文娟，卢昆鹏，胡绍旺，
申请(专利权)人：吉林农业大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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