一种水产品中有机镉的细胞毒性评价方法技术

本发明专利技术公开了一种水产品中有机镉细胞毒性的评价方法，首先通过有机镉对PC12细胞暴露，提取细胞内小分子代谢物，利用色谱质谱联用技术对细胞中心碳代谢相关的代谢物进行检测分析，通过与对照组细胞的代谢物进行比较，根据代谢物变化显著性差异评价有机镉对细胞产生的毒性作用机制，构建一种评估细胞受有机镉暴露后中心碳代谢通路变化的方法。本发明专利技术能有效的分析有机镉对细胞代谢途径的影响，具有简单，快速，获得信息全面等优点。

A cytotoxic evaluation method of organic cadmium in aquatic products

【技术实现步骤摘要】
一种水产品中有机镉的细胞毒性评价方法
本专利技术属于水产品重金属污染毒性评价领域，具体涉及一种水产品中有机镉的细胞毒性评价方法，是一种基于色谱质谱联用技术的评估方法，通过有机镉对细胞代谢路径的影响来评估不同赋形态镉对细胞毒性的作用机制以及毒性评价。
技术介绍
因矿产资源的大量开发，工业的迅猛发展，大量镉元素已通过多种渠道进入水体，引起水生生物的重金属污染。环境中的镉含量很低，但许多水生生物对镉具有极强的富集能力，如鱼类可富集103～105倍，贝类可富集105～106倍，镉可沿食物链转移蓄积，最终危害人类身体健康。所以，镉已成为影响水产品食用安全的重要因素之一。无机镉和有机镉(生物镉)是镉存在生物体内的两大形态。镉在环境中一般以无机离子态存在，但其进入生物体中，会与其诱导细胞产生的MT中的巯基络合形成更加稳定的有机态镉。目前对镉的毒性研究主要集中在生理生化、显微亚显微水平上，而对镉的毒性机制，特别是其毒性分子机制的研究还处于比较初级的阶段。机体中各种代谢物相互作用，相互关联而使机体能够维持正常的生理活动，当机体受到外界刺激影响时会引起生物体内关键代谢过程中内源性物质的浓度，会造成机体代谢紊乱进而影响正常的生命活动。外界影响和刺激所引起机体的生理变化在代谢过程中会被反映和放大，代谢组学技术能够将成百上千种代谢物的变化通过谱图的方式展现出来，能很好地表征毒物毒性通路和作用机制，所以代谢组学技术在毒性作用机制研究上具有很大的优势。当前的技术大多使用小鼠模型评测重金属毒性，实验过程繁琐，所用时间较长，效率低。该方法能有效的分析有机镉对细胞代谢途径的影响，具有简单，快速，获得信息全面等优点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种评估有机镉细胞毒性的方法。首先利用色谱质谱联用技术对细胞内小分子代谢产物进行有效的分析，利用生物学检测方法能对代谢物进行快速分析，评估有机镉的暴露对细胞代谢的影响。该方法能直观的分析有机镉对细胞代谢途径的影响，具有简单，快速，获得信息全面等优点。本专利技术为实现上述目的所采用的技术方案是：以PC12细胞为模式细胞，以重金属镉以及镉-鲍鱼多糖复合物对PC12细胞进行暴露，分析了胞内中心碳代谢相关的极性小分子代谢产物变化，研究了不同赋性态镉暴露对细胞中心碳代谢产生的影响。一种水产品中有机镉的细胞毒性评价方法，具体包括以下步骤：S1、取大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12(高分化)于培养板培养20～26h，待PC12(来自中国科学院细胞库)细胞铺满孔板被培养基覆盖面的80％～90％，用镉离子以及鲍鱼多糖-镉混合物对细胞进行暴露20～24h后收取细胞样品；S2、取步骤S1所述细胞样品，提取细胞内小分子代谢物；S3、利用LC-MS的质谱方法对所述小分子代谢物进行定量分析；色谱柱用亲水作用色谱柱，所述色谱柱包括：Waters,UPLCBEHAmidecolumn(1.7μm,2.1×100mm)、HPLCLunaaminopropylcolumn(3.0μm,2.0×100mm)、SeQuantZIC-HILICcolumn(3.5μm,2.1×100mm)、XbridgeAmide(3.5μm,4.6×100mm)中的一种。优选方式下，所述水产品中有机镉的细胞毒性评价方法，包括步骤：S1：以PC12细胞为模式细胞，对细胞进行培养与暴露，步骤如下：取PC12细胞接种于六孔板，分别设置空白组，镉暴露组，鲍鱼多糖-镉联合暴露组，每组接种1个六孔板，共使用3个六孔板接；所述六孔板中接种细胞密度为1～2×105个/mL，每孔内加入完全培养基1～3ml；所述完全培养基为GIBCO的高糖DMEM，含4500mg/L葡萄糖，含体积分数为10％(v/v)的胎牛血清和0.5％～1％(v/v)的青霉素-链霉素；在培养箱内培养的条件为37℃，空气中含5％(v/v)的CO2，培养20～26h；移弃所述六孔板的孔内溶液，空白组重新加入新的完全培养基，每孔1～2ml；氯化镉暴露组加入完全培养基稀释的20～25μM氯化镉溶液，每孔1～2ml；鲍鱼多糖-镉混合液暴露组加入多糖镉混合液每孔1～2mL；置于37℃、空气中含5％(v/v)的CO2培养20～26h；其中，所述多糖镉混合液中包含20～25μM氯化镉、50～100mg/mL的鲍鱼多糖，余量为完全培养基；所述鲍鱼多糖制备方法来自Song,Shuang.,Zhang,Bao.,Wu,Sufeng.,Huang,Lu.,Ai,Chunqing.,Pan,Jinfeng.,Su,Yi-Cheng.,Wang,Zhongfu.,&Wen,Chengrong.,Structuralcharacterizationandosteogenicbioactivityofasulfatedpolysaccharidefrompacificabalone(HaliotisdiscushannaiIno).实际检测时，可根据实际情况选取其他的含有镉的水产品成分进行检测；S2、移弃所述六孔板中的溶液，每孔加入新的完全培养基，置于37℃，空气中含5％(v/v)的CO2培养箱内继续培养20～24h；将六孔板放在干冰上，每孔加入2～5μL内标混合液、2～3ml体积分数为80％～90％甲醇，-80℃静置孵育20～25分钟；其中，所述内标混合液由1mg/mL内标十一烷酸、1mg/mL十九烷酸以及2mg/mLL-苯丙氨酸按体积比2:2:1混合而成；将所述六孔板放于干冰上，按下述方法分别提取空白组、镉暴露组和鲍鱼多糖-镉混合液组的细胞代谢物：以空白组为例，共6个孔，用细胞刮刀刮取空白组每孔的细胞，并用枪头吹打孔中刮取的细胞，将空白组每3个孔为一组，将三个孔内液体共同转移到离心管A内，每个孔再加入1～2ml甲醇进行吹悬并再次转移到离心管A内；将所述离心管A4～8℃、10000g～15000g离心5～10min，使细胞碎片颗粒化，取上清到离心管B，将所述离心管A中沉淀再次使用1～2ml甲醇清洗吹悬并在4～8℃、10000g～15000g离心5～10min，再次转移上清到离心管B中，所述离心管B中的液体即为细胞提取液；将所述细胞提取液进行氮吹至离心管中无液体，得到细胞代谢物，加入150～200μl乙腈复溶，并过孔径为0.22μm的有机滤膜过滤，得待测试样；镉暴露组和鲍鱼多糖-镉混合液组的孔内代谢物的提取都按照此操作步骤进行；S3、利用LC-MS的质谱方法对小分子细胞代谢物进行定量分析，建立超高效液相色谱串联三重四级杆质谱分析方法对胞内外代谢产物进行定量分析，由于代谢物分子性质的不同，分为正负离子两种扫描模式，色谱条件如下所述：色谱柱用亲水作用色谱柱XbridgeAmide(粒径3.5μm，4.6×100mm)，色谱条件为：流速为0.35～0.4mL/min，柱温为55℃，步骤S2所述待测试样的进样量为3～10μL；流动相A为含乙腈5％～10％(v/v)、含20mM～25mM氢氧化铵、含20mM～25mM乙酸铵的超纯水，B相为纯乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种水产品中有机镉的细胞毒性评价方法，其特征在于，包括步骤：/nS1：以PC12细胞为模式细胞，对细胞进行培养与暴露，步骤如下：取PC12细胞接种六孔板，分别设置空白组，镉暴露组，鲍鱼多糖-镉联合暴露组，每组接种1个六孔板，共使用3个六孔板；所述六孔板中每孔接种细胞密度为1～2×10

【技术特征摘要】
1.一种水产品中有机镉的细胞毒性评价方法，其特征在于，包括步骤：
S1：以PC12细胞为模式细胞，对细胞进行培养与暴露，步骤如下：取PC12细胞接种六孔板，分别设置空白组，镉暴露组，鲍鱼多糖-镉联合暴露组，每组接种1个六孔板，共使用3个六孔板；所述六孔板中每孔接种细胞密度为1～2×105个/mL，加入完全培养基1～3ml；培养条件为37℃，空气中含5％的CO2，培养20～26h；移弃所述六孔板孔内的溶液，空白组重新加入完全培养基，每孔1～2ml；氯化镉暴露组加入完全培养基稀释的20～25μM氯化镉溶液，每孔1～2ml；鲍鱼多糖-镉混合液暴露组加入多糖镉混合液每孔1～2mL；置于37℃、空气中含5％的CO2培养20～26h；其中，所述多糖镉混合液中包含20～25μM氯化镉、50～100mg/mL的鲍鱼多糖，余量为完全培养基；所述完全培养基为GIBCO的高糖DMEM，含4500mg/L葡萄糖、体积分数为10％的胎牛血清和体积分数0.5％～1％的青霉素-链霉素；
S2、移弃所述六孔板中的溶液，每孔加入完全培养基，置于37℃，空气中含5％的CO2培养箱内继续培养20～24h；将所述六孔板放在干冰上，每孔加入2～5μL内标混合液、2～3ml体积分数为80％～90％甲醇，-80℃静置孵育20～25分钟；其中，所述内标混合液由1mg/mL内标十一烷酸、1mg/mL十九烷酸以及2mg/mLL-苯丙氨酸按体积比2:2:1混合而成；
将所述六孔板放于干冰上，按下述方法分别提取空白组、镉暴露组和鲍鱼多糖-镉混合液组的细胞代谢物：以空白组为例，空白组细胞共培养6个孔，用细胞刮刀刮取空白组每孔的细胞，并用枪头吹打孔中刮取的细胞，将空白组每3个孔为一组，将3个孔内液体共同转移到离心管A内，每个孔再加入1～2ml甲醇进行吹悬并再次转移到离心管A内；将所述离心管A4～8℃、10000g～15000g离心5～10min，取上清到离心管B，将所述离心管A中沉淀再次使用1～2ml甲醇清洗吹悬并在4～8℃、10000g～15000g离心5～10min，再次转移上清到离心管B中，所述离心管B中的液体即为细胞提取液；将所述细胞提取液进行氮吹至离心管中无液体，得到细胞代谢物，加入150～200μl乙腈复溶，使用孔径0.22μm的有机滤膜过滤得待测试样；所述镉暴露组和鲍鱼多糖-镉混合液组的孔内代谢物的提取都按照此操作步骤进行；
S3、利用LC-MS的质谱方法对小分子细胞代谢物进行定量分析，建立超高效液相色谱串联三重四级杆质谱分析方法对胞内外代谢产物进行定量分析，分为正负离子两种扫描模式，色谱条件如下所述：色谱柱用亲水作用色谱柱XbridgeAmide，粒径3.5μm、直径4.6mm、长度100mm，色谱条件为：流速0.35～0.4mL/min，柱温为55℃，步骤S2所述待测试样的进样量3～10μL；流动相A为含体积分数5％～10％乙腈、20mM～25mM氢氧化铵、20mM～25mM乙酸铵的超纯水，流动相B为乙腈；流动相洗脱程序为：0～1.5min，流动相体积分数A为65％～70％、流动相B为30％～35％；1.5～15.5min内，流动相A体积分数线性降低到10％～20％，流动相B体积分数线性升高到80％～90％；15.5～15.6min内，流动相A体积分数线性降低到3％～5％，流动相B体积分数线性升高到95％～97％；维持2.4min，18～18.1min内流动相A体积分数线性升高到65％～70％，流动相B体积分数线性下降到30％～35％；18.1～20min，流动相A、B体积分数不变，流动相A相体分数65％～70％，流动相B相体积分数30％～35％；正负离子扫描模式均为ScheduledMRM模式，所述定量分析过程20min；
S4、统计学分析处理色谱柱XbridgeAmide检测到的胞内代谢产物，找出含量显著变化的代谢产物，做出所述代谢产物的偏最小二乘分析、代谢通路图...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海涛，王庆红，谭明乾，程沙沙，齐子和，张丽娟，那晓康，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21